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https://repositorio.ufu.br/handle/123456789/36184
ORCID: | http://orcid.org/0000-0002-7642-1122 |
Document type: | Tese |
Access type: | Acesso Embargado |
Embargo Date: | 2024-09-13 |
Title: | Produção em fermentação submersa e avaliação da imobilização de fosfatases ácidas de Trichoderma spp. |
Alternate title (s): | Produção em fermentação submersa e avaliação da imobilização de fosfatases ácidas de Trichoderma spp. |
Author: | Lima, Frederico Alves |
First Advisor: | Resende, Miriam Maria de |
Second Counselor: | Seijas, Jose Mauel Guisa |
First member of the Committee: | Sérvulo, Eliana Flávia Camporese |
Second member of the Committee: | Kamimura, Eliana Setsuko |
Third member of the Committee: | Mendes, Gilberto de Oliveira |
Fourth member of the Committee: | Ribeiro, Eloízio Júlio |
Fifth member of the Committee: | Santos, Líbia Diniz |
Summary: | Fosfatases ácida (ACPases) são hidrolases que promovem a hidrólise do fosfato monoéster, transformando o fosfato orgânico em uma forma inorgânica solúvel. Estas enzimas podem ser produzidas por uma variedade de fungos, que ganhou atenção em decorrência de seu potencial biotecnológico em processos industriais de diagnóstico e de biorremediação. As ACPases desempenham um papel específico na mobilização e aquisição de fosfato, aumentando a fertilidade do solo, e o crescimento das plantas. Diante da relevância e do potencial de aplicação biotecnológica dessas fosfatases, o presente trabalho propõe a avaliação de sua produção em meios de cultivo de baixo custo, e também sua imobilização em suportes. Os testes preliminares foram fundamentais para analisar o potencial de produção enzimática das três cepas de Trichoderma, e, também, definir o meio de cultivo MC-2 a ser otimizado para cada microrganismo. Assim, por meio do Planejamento Composto Central foi possível desenvolver equações de atividade da fosfatase ácida (U/mL) usando como parâmetros três reagentes: sacarose, extrato de levedura, e fosfato de potássio monobásico. Os melhores resultados foram para o Trichoderma reesei, utilizando-se o meio MSO-Tr obteve-se crescimento de biomassa celular e atividade enzimática, cujos valores finais médios foram de 5,32 ± 0,48 g/L e 1,96 ± 0,14 U/mL, respectivamente, consumindo toda glicose e sacarose após decorridas 48 h. O Trichoderma harzianum teve potencial de produção enzimático intermediário. Utilizando-se o meio selecionado MSO-Th, as cinéticas de crescimento celular, e atividade enzimática chegaram a um valor final médio de 3,58 ± 0,27 g/L e 0,81 ± 0,05 U/mL, respectivamente. O Trichoderma asperellum, com o meio selecionado MSO-Ta, obteve resultados próximos aos do Trichoderma harzianum. Também, foi avaliada a produção da ACPase, utilizando melaço de soja como única fonte nutritiva. Os melhores resultados para as fermentações submersas foram utilizando o melaço de soja bruto. O Trichoderma reesei destacou apresentando o melhor crescimento de biomassa celular com 6,82 ± 0,43 (g/L) para o meio MS75, suplementado com 75 g/L de melaço de soja. Por outro lado, o Trichoderma harzianum teve destaque na atividade enzimática, chegando a valores de 4,15 ± 0,14 (U/mL), com o meio de cultivo suplementado com 100 g/L desse substrato. Nesse trabalho também foi estudado uma técnica simples e rápida de imobilização enzimática baseada na troca iônica para melhorar a estabilidade térmica das fosfatases ácidas. A imobilização não foi eficiente para os suportes DEAE-Sepharose, e Manae agarose. Por outro lado, Toyopearl DEAE-650s mostrou-se promissor, com rendimento de imobilização acima de 95%, e recuperação de atividade acima de 85%, para ambas as enzimas. A fim de melhorar esses biocatalisadores para resistirem à altas temperaturas, uma segunda etapa foi introduzida no processo. Para isso, foram realizadas reações de oxidação e redução das cadeias glicosídicas da fosfatase ácida, permitindo demonstrar a formação de grupos de aldeídos, e posterior interação com os grupos aminas, e verificar a estabilidade das diferentes formas (livre e imobilizada). Ambos os biocatalisadores apresentaram atividade residual após uma hora de inativação, na temperatura de 60 ºC, fato não observado para a enzima livre. O derivado de trigo germinado foi o melhor, apresentando atividade residual de 66,7% no derivado apenas imobilizado, e 76,2% para o derivado oxidado/reduzido. A imobilização dos extratos enzimáticos produzidos pelas cepas de Trichoderma tiveram melhor desempenho no suporte Glioxil Agarose com PEI de 600-1000 KDa com destaque para o Trichoderma asperellum. Palavras-chave: Fosfatase ácida, Trichoderma spp., Trichoderma harzianum, Trichoderma reesei, otimização meio de cultivo, melaço de soja, imobilização, Toyopearl DEAE-650s, estabilidade térmica. |
Abstract: | Acid phosphatases (ACPases) are hydrolases that promote the hydrolysis of the phosphate monoester by transforming the organic phosphate into a soluble inorganic form. These enzymes can be produced by a variety of fungi, they also have biotechnological potential in industrial, diagnostic and bioremediation processes. ACPases play a specific role in the mobilization and acquisition of phosphate, increasing soil fertility and plant growth. Thus, considering the biotechnological application of these acids phosphatases, the present work aimed to evaluate the production in low-cost culture media, and also their immobilization in supports. The preliminary tests were important to check the enzymatic production potential of the 3 Trichoderma strains and also to define the MC-2 culture medium to be optimized for each microorganism. Through Central Compound Planning it was possible to develop equations of acid phosphatase activity (U/mL) using as parameters three reagents: sucrose, yeast extract and KH2PO4. The best results were for Trichoderma reesei using the MSO-Tr medium obtained cell biomass growth and enzymatic activity of 5.32 ± 0.48 g/L and 1.96 ± 0.14 U/mL, respectively, it was also consumed whole glucose and sucrose after 48 hours. Trichoderma harzianum played an intermediary role in enzyme production. Using the selected MSO-Th medium, cell growth kinetics and enzyme activity were 3.58 ± 0.27 g/L and 0.81 ± 0.05 U/mL, respectively. Trichoderma asperellum with the selected MSO-Ta medium obtained results similar to those of Trichoderma harzianum. ACPase production using soy molasses as the only nutritional source was also evaluated. The best results for submerged fermentations were using raw soy molasses. Trichoderma reesei showed the best growth of cell biomass with 6.82 ± 0.43 (g/L) for MS75 medium, supplemented with 75 g/L of soybean molasses. On the other hand, Trichoderma harzianum was highlighted in the enzymatic activity, reaching values of 4.15 ± 0.14 (U/mL), with the culture medium supplemented with 100 g/L of this substrate. In this work, a simple and fast technique of enzymatic immobilization based on ion exchange was also studied to improve the thermal stability of acid phosphatases. Immobilization was not efficient for the supports DEAE-Sepharose, and Manae agarose. On the other hand, Toyopearl DEAE-650s showed promise, with immobilization yield above 95% and activity recovery above 85%, for both enzymes. In order to improve these biocatalysts to withstand high temperatures, a second step was introduced into the process. Therefore, oxidation and reduction reactions of the glycosidic chains of the ACPases were carried out, allowing to demonstrate the formation of aldehyde groups and subsequent interaction with the amine groups, in addition to verifying the stability of the different forms (free and immobilized). Both biocatalysts showed residual activity after 1 hour of inactivation at a temperature of 60 ºC, which was not observed for the free enzyme. The germinated wheat derivative was the best, with residual activity of 66.7% for the single immobilized derivative and 76.2% for the oxidized/reduced derivative. The immobilization of enzymatic extracts produced by Trichoderma strains had a better performance on Glyoxil Agarose support, with an emphasis on Trichoderma asperellum. Key-words: Acid phosphatase, Trichoderma strains, culture medium optimization, soybean molasses, immobilization, Toyopearl DEAE-650s, thermal stability. |
Keywords: | Fosfatase ácida Acid phosphatase Trichoderma spp. Trichoderma harzianum Trichoderma reesei otimização meio de cultivo melaço de soja imobilização Toyopearl DEAE-650s estabilidade térmica. Trichoderma strains culture medium optimization soybean molasses immobilization Toyopearl DEAE-650s thermal stability. |
Area (s) of CNPq: | CNPQ::ENGENHARIAS::ENGENHARIA QUIMICA::PROCESSOS INDUSTRIAIS DE ENGENHARIA QUIMICA::PROCESSOS ORGANICOS |
Subject: | Engenharia Química Adubos e fertilizantes orgânicos Melhoramento de cultivos agrícolas |
Language: | por |
Country: | Brasil |
Publisher: | Universidade Federal de Uberlândia |
Program: | Programa de Pós-graduação em Engenharia Química |
Quote: | LIMA, Frederico Alves. Produção em fermentação submersa e avaliação da imobilização de fosfatases ácidas de Trichoderma spp. 2021. 141 f. Tese (Doutorado em Engenharia Química) - Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 2021. DOI http://doi.org/10.14393/ufu.te.2022.5003. |
Document identifier: | http://doi.org/10.14393/ufu.te.2022.5003 |
URI: | https://repositorio.ufu.br/handle/123456789/36184 |
Date of defense: | 23-Nov-2021 |
Appears in Collections: | TESE - Engenharia Química |
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