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ORCID:  http://orcid.org/0000-0003-0618-0885
Document type: Dissertação
Access type: Acesso Aberto
Title: Desenvolvimento de protocolos de ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) para detecção de proteínas transgênicas CRY2A e VIP3A em milho (Zea mays L.)
Alternate title (s): Development of enzyme-linked immunosorbent assay protocols for detection of CRY2A and VIP3A transgenic proteins in maize (Zea mays L.)
Author: Paulino, Willian Elias
First Advisor: Gomes, Luiz Antonio Augusto
First member of the Committee: Teixeira, Terezinha Aparecida
Second member of the Committee: Gonçalves, Nayara Roberto
Summary: O milho (Zea mays L.) representa uma cultura anual de alto impacto econômico e social. Por ser afetada por diferentes pragas no campo, híbridos transgênicos resistentes a insetos foram rapidamente difundidos no mercado. As principais proteínas responsáveis por esta resistências são as proteínas da família Cry, como a Cry2a, e a proteína Vip3a. Para verificar a presença e expressão dos genes ou suas respectivas proteínas, diferentes métodos podem ser utilizados, sendo o teste ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) um deles. ELISA é baseado na interação antígeno-anticorpo e na reação da enzima ligada ao anticorpo com o seu substrato cromóforo, aonde a mudança de coloração indica que há presença da molécula-alvo. Os anticorpos utilizados no teste podem ser monoclonais ou policlonais. Existem diferentes tipos de ELISA, sendo o ELISA direto (sem anticorpo de captura) e o ELISA sanduíche (com anticorpo de captura) os mais comuns para analisar presença de antígenos. O objetivo deste trabalho foi testar e desenvolver um protocolo de ELISA sanduíche utilizando anticorpos policlonais para detectar expressão de Cry2a em sementes de milho e um protocolo de ELISA direto para detectar proteína Vip3a em sementes e plântulas de milho transgênico. Os anticorpos policlonais anti-Cry2a foram produzidos e isolados pela MyBiosource. As sementes foram trituradas, raízes e parte aérea de plântulas foram cortadas e adicionou-se solução-tampão para extração de proteínas destes tecidos. Foi testada a variação no volume de amostra, concentração de anticorpos de captura, concentração de anticorpo conjugado, volume de substrato e especificidade para a placa de ELISA Cry2a. Para montagem das placas de ELISA direto para Vip3a, foram testados volumes de amostra de diferentes tecidos e volume de conjugado aplicado. Os resultados demonstraram que o protocolo testado para ELISA sanduíche utilizando anticorpos policlonais foi sensível e específico na identificação de amostras que expressam a proteína Cry2a, porém os resultados de ELISA direto para detectar a proteína Vip3a foram inconsistentes e seria melhor desenvolver também um protocolo de ELISA sanduíche para esta proteína.
Abstract: Maize (Zea mays L.) represents an annual crop with high economic and social impact. As it is affected by different pests in the fields, insect-resistant transgenic hybrids were quickly disseminated in the worldwide market. The main proteins responsible for this resistance are the Cry family proteins, such as Cry2a, and the Vip3a protein. To verify the presence and expression of genes or their respective proteins, different methods can be used, ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) is an example. Antibodies used in the assay can be monoclonal or polyclonal. There are different types of ELISA, the most common being the direct ELISA (without capture antibody) and the sandwich ELISA (with capture antibody) to analyze the presence of antigens. The aim of this work was to test and develop a sandwich ELISA protocol using polyclonal antibodies to detect Cry2a expression in corn seeds and a direct ELISA protocol to detect Vip3a protein in transgenic corn seeds and plantlets. Anti-Cry2a polyclonal antibodies were produced and isolated by MyBiosource. Seeds were crushed, roots and shoots were cut from plantlets and buffer solution was added to extract proteins from these tissues. Variation in sample volume, capture antibody concentration, conjugated antibody concentration, substrate volume and specificity for the Cry2a ELISA plate were tested. To assemble the direct ELISA plates for Vip3a, sample volumes from different tissues and applied conjugate volume were tested. The results demonstrated that the sandwich ELISA protocol using polyclonal antibodies was specific and sensible to identify Cry2a expression in maize seeds samples. However, the results for direct ELISA in order to detect Vip3a protein in samples were inconsistent and developing a sandwich ELISA protocol for this protein must be considered too.
Keywords: ELISA
Milho
Bt
Cry2a
Vip3a
Maize
Area (s) of CNPq: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::GENETICA::GENETICA VEGETAL
Subject: Biotecnologia
Language: por
Country: Brasil
Publisher: Universidade Federal de Uberlândia
Program: Programa de Pós-graduação em Biotecnologia
Quote: PAULINO, Willian Elias. Desenvolvimento de protocolos de ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) para detecção de proteínas transgênicas CRY2A e VIP3A em milho (Zea mays L.). 2021. 53 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Universidade Federal de Uberlândia, Patos de Minas, 2021. DOI http://doi.org/10.14393/ufu.di.2021.516
Document identifier: http://doi.org/10.14393/ufu.di.2021.516
URI: https://repositorio.ufu.br/handle/123456789/32822
Date of defense: 13-Aug-2021
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