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Document type: Tese
Access type: Acesso Aberto
Title: Maturação ovocitária in vitro avaliada conforme sistemas de cultivo bidimensional e tridimensional
Alternate title (s): In vitro oocyte maturation evaluated according to two-dimensional and three-dimensional culture systems
Author: Ribeiro Júnior, José Pires
First Advisor: Goulart Filho, Luiz Ricardo
First member of the Committee: Alves, Kele Amaral
Second member of the Committee: Alves, Bênner Geraldo
Third member of the Committee: Santos, Ricarda Maria dos
Fourth member of the Committee: Diniz, Angélica Lemos Debs
Summary: O sucesso da produção in vitro de embriões está diretamente ligado à qualidade dos ovócitos e as condições de cultivo in vitro. Na primeira etapa da produção denominada maturação, que se refere à cultura in vitro de ovócitos imaturos, os ovócitos são selecionados e recebem estímulos, das aspiração folicular e da composição provenientes do meio no qual estão inseridos para evolução da meiose, envolvendo alterações nucleares e citoplasmáticas essenciais para a fecundação e posterior desenvolvimento embrionário. Entretanto as taxas de produtividade se mantêm estacionadas e novos estudos devem ser conduzidos com a finalidade de melhorar a qualidade dos ovócitos após a fase de maturação in vitro. Dessa forma, este estudo foi conduzido com dois experimentos distintos com o objetivo de: 1- Avaliar a maturação de ovócitos bovinos com ou sem células do cúmulus em sistemas de cultivo in vitro tridimensional com uso de matriz de colágeno e comparar o sistema tradicional bidimensional; 2- Comparar os métodos de avaliação visual em microscópio invertido e por microscopia de fluorescência após o processo de maturação ovocitária. O percentual de ovócitos em vesícula germinativa foi superior nos sem células do cúmulus. Os ovócitos com células do cúmulus em sistema tridimensional de cultivo apresentou menor percentual de ovócitos em metáfase I. Adicionalmente, as taxas de metáfase II foram superiores nos com células do cúmulus independente do sistema de cultivo. Em adição, a porcentagem de ovócitos rompidos foi superior no com células do cúmulus em cultivo 3D em relação aos demais. Diferentes abordagens foram utilizadas para a avaliação da cromatina do ovócito pós-maturação. Na avaliação por microscópio invertido, os parâmetros presença do corpúsculo polar e extrusão foram avaliados. No geral, o com células do cúmulus em sistema 3D apresentou maior porcentagem de ovócitos com extrusão de corpúsculo polar. Os parâmetros analisados vesícula germinativa (microscopia fluorescência) versus ausência de corpúsculo polar (microscópio invertido) e metáfase II (microscopia fluorescência) versus presença de corpúsculo polar (microscópio invertido) foram comparados entre as abordagens utilizadas: microscopia fluorescência verso microscópio invertido. No geral, a porcentagem de ovócitos em vesícula germinativa (microscopia fluorescência) foi menor em comparação a proporção de ovócitos observados com ausência de corpúsculo polar (microscópio invertido). Em contrapartida, a porcentagem de ovócitos em metáfase II (microscopia fluorescência) foi superior em relação àqueles identificados com presença de corpúsculo polar (microscópio invertido). Em síntese, considerando os resultados obtidos por meio da análise de microscopia fluorescência (eletivo como padrão ouro), a retomada da meiose após o cultivo in vitro de ovócitos com células do cúmulus foi semelhante entre os sistemas 2D e 3D. Dentro do mesmo sistema avaliado (2D ou 3D), a ausência de células do cúmulus comprometeu a retomada da meiose. Em adição, ovócitos maturados no sistema 3D apresentaram maior ocorrência de danos na zona pelúcida.
Abstract: The success of in vitro embryo production is directly linked to the quality of the oocytes and the conditions of in vitro culture. In the first stage of production called maturation, which refers to the in vitro culture of immature oocytes, the oocytes are selected and receive stimuli, follicular growth and composition from the medium in which they are inserted for the evolution of meiosis, involving nuclear and cytoplasmic changes essential for fertilization and subsequent embryonic development. However, productivity rates remain unchanged and further studies should be conducted in order to improve the quality of oocytes after the in vitro maturation phase. Thus, this study was conducted with two different experiments with the objective of: 1- Assessing the maturation of bovine oocytes with or without cumulus cells in three-dimensional in vitro culture systems using collagen matrix and comparing the traditional two-dimensional system; 2- Compare the methods of visual evaluation using an inverted microscope and fluorescence microscopy after the oocyte maturation process. The percentage of oocytes in the germinal vesicle was higher in those without cumulus cells. The oocytes with cumulus cells in a three-dimensional culture system showed a lower percentage of oocytes in metaphase I. Additionally, metaphase II rates were higher in those with cumulus cells regardless of the culture system. In addition, the percentage of ruptured oocytes was higher in the cumulus cells in 3D culture compared to the others. Different approaches were used to evaluate the oocyte chromatin post-maturation. In the evaluation by an inverted microscope, the parameters presence of the polar corpuscle and extrusion were evaluated. In general, the cumulus cells in 3D system showed a higher percentage of oocytes with polar body extrusion. The parameters analyzed germinal vesicle (fluorescence microscopy) versus absence of polar corpuscle (inverted microscope) and metaphase II (fluorescence microscopy) versus presence of polar corpuscle (inverted microscope) were compared between the approaches used: fluorescence microscopy versus inverted microscope. In general, the percentage of oocytes in the germinal vesicle (fluorescence microscopy) was lower compared to the proportion of oocytes observed with the absence of a polar corpuscle (inverted microscope). On the other hand, the percentage of oocytes in metaphase II (fluorescence microscopy) was higher than those identified with the presence of a polar corpuscle (inverted microscope). In summary, considering the results obtained through the analysis of fluorescence microscopy (elective as gold standard), the resumption of meiosis after the in vitro cultivation of oocytes with cumulus cells was similar between the 2D and 3D systems. Within the same evaluated system (2D or 3D), the absence of cumulus cells compromised the resumption of meiosis. In addition, oocytes matured in the 3D system showed a higher occurrence of damage in the pellucid zone.
Keywords: Cromatina
Cultivo tridimensional
Maturação nuclear
Metáfase II
Chromatin,
metaphase II
nuclear maturation
three-dimensional cultivation
Area (s) of CNPq: CNPQ::CIENCIAS DA SAUDE::MEDICINA
Subject: Maturação
Cromatina
Fertilização in vitro
Language: por
Country: Brasil
Publisher: Universidade Federal de Uberlândia
Program: Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde
Quote: RIBEIRO JÚNIOR, José Pires. Maturação ovocitária in vitro avaliada conforme sistemas de cultivo bidimensional e tridimensional. 2020. 52 f. Tese (Doutorado) - Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 2020. DOI http://doi.org/10.14393/ufu.te.2020.842
Document identifier: http://doi.org/10.14393/ufu.te.2020.842
URI: https://repositorio.ufu.br/handle/123456789/31457
Date of defense: 14-Oct-2020
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