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Document type: Dissertação
Access type: Acesso Embargado
Title: Efeito do óxido nítrico sobre a atividade e expressão da ntpdase1 e da ecto-5'-nucleotidase em linhagens de células vasculares
Alternate title (s): Effect of nitric oxide on the activity and expression of ntpdase1 and ecto-5'-nucleotidase in vascular cell line
Author: Araújo, Bruna Juber de
First Advisor: Fürstenau, Cristina Ribas
First member of the Committee: Araújo, Thaíse Gonçalves de
Second member of the Committee: Moraes, Grace Schenatto Pereira
Summary: Compreender os mecanismos que atuam na vasculatura representa um caminho promissor para o desenvolvimento e entendimento de novos estudos para as desordens vasculares. Os nucleotídeos extracelulares (ATP, ADP) e o nucleosídeo adenosina modulam o vasorelaxamento e a vasoconstrição, e estão envolvidos na produção do vasodilatador óxido nítrico (NO). Permanece por ser investigado se o NO é capaz de modular as ectonucleotidases, enzimas que hidrolisam os nucleotídeos, controlado sua disponibilidade no meio extracelular. As NTPDases 1 e 2 hidrolisam ATP e ADP; e a ecto-5’-nucleotidase metaboliza AMP até adenosina, também um vasodilatador. Para determinar o efeito do NO sobre as ectonucleotidases vasculares, células musculares lisas vasculares A7r5 e células endoteliais tEnd.1 foram tratadas com agente doador de NO (nitroprussiato de sódio (SNP)), inibidor da síntese de NO (L-NAME) e mobilizadores de NO (ATP, ADP, bradicinina (BK) e 2-Cl-adenosina). Após 24 horas, através do ensaio de MTT, notou-se uma diminuição de 35% na viabilidade das células A7r5 tratadas com 2-Cl-adenosina (10-4M). Os níveis de nitrito, dosados pelo reagente de Griess, aumentaram nos dois tipos celulares em resposta ao SNP, indicando um aumento indireto dos níveis de NO. As atividades enzimáticas foram detectadas colorimetricamente pelo fosfato inorgânico liberado. As hidrólises de ATP e ADP não foram alteradas. Entretanto, a hidrólise de AMP foi significativamente aumentada pelo ATP e 2-Cl-adenosina em A7r5; e pelo ATP e ADP em tEnd.1. O aumento na atividade da ecto-5’-nucleotidase parece ser importante para aumentar os níveis de adenosina circulante, já que ela é fundamental para garantir a regulação da homeostase e a manutenção do tônus vascular. A tentativa de avaliação da expressão gênica das ectonucleotidases em resposta aos tratamentos em células A7r5 não foi bem-sucedida. Ainda, não foram encontradas alterações em nível proteico, avaliado por Western blotting. Porém, o aumento na atividade da enzima poderia ser explicado pela presença de sítios específicos altamente fosforiláveis em sua estrutura, principalmente em resíduos de serina. Embora os resultados obtidos nos levem a crer que as ectonucleotidases sejam moduladas independentemente do NO em A7r5, experimentos adicionais são necessários para confirmar a concentração de NO no meio de cultivo de tais células e os níveis de regulação sofridos pelas enzimas em questão. A compreensão de tais funções e mecanismos de ação do NO e outras moléculas vasoativas sobre as ectonucleotidases vasculares são fundamentais para a compreensão das desordens vasculares.
Abstract: Understanding the mechanisms that act in the vasculature represent a promising path for the development and understanding of future studies about vascular disorders. It is known that extracellular nucleotides (ATP, ADP) and nucleoside adenosine are able to modulate vasorelaxation and vasoconstriction and are involved in the production of the vasodilator nitric oxide (NO). It remains to be investigated whether NO is able to modulate the expression and activity of ectonucleotidases, enzymes that hydrolyze nucleotides controlling their availability in the extracellular environment. NTPDases 1 and 2 hydrolyze ATP and ADP and ecto-5'-nucleotidase metabolizes AMP to adenosine, also a vasodilator. To determine the effect of NO on vascular ectonucleotidases, vascular smooth muscle cells A7r5 and endothelial cells tEnd.1 were treated with NO donor (sodium nitroprusside (SNP)), inhibitor of NO synthesis (L-NAME) and mobilizers of NO (ATP, ADP, bradykinin (BK) and 2-Cl-adenosine). After 24 hours, a 35% decrease in cell viability of A7r5 cells was observed by MTT assay in response to 2-Cl-adenosine (10-4M). Nitrite levels, measured by Griess's reagent, significantly increased in the two cell types treated with SNP, indicating an indirect increase in NO levels. The enzymatic activities were detected colorimetrically by the inorganic phosphate released. The hydrolysis of ATP and ADP was not altered. However, AMP hydrolysis was significantly increased by ATP and 2-Cl-adenosine in A7r5 cells and by ATP and ADP in tEnd.1 cells. The increase in ecto-5'-nucleotidase activity seems to be important to increase levels of circulating adenosine, since it is of great importance to ensure regulation of homeostasis and maintenance of vascular tone. The attempt to evaluate the gene expression of ectonucleotidases in response to treatments in A7r5 cells was not successful. Besides, no changes were found in protein level, as assessed by Western blotting. However, the increase in enzyme activity could be explained by the presence of specific highly phosphorylable sites, especially in serine residues, in the structure of the ecto-5'- nucleotidase. Although the results obtained lead us to believe that the ectonucleotidases are modulated independently of the NO in A7r5, additional experiments are required to confirm the concentration of NO in the culture medium of such cells and the levels of regulation undergone by the enzymes in question. The understanding of the functions and mechanisms of action of NO and other vasoactive molecules on vascular ectonucleotidases are of fundamental relevance for the understanding of vascular disorders.
Keywords: Biotecnologia
Purinérgicos
Óxido nítrico
Vasculatura
Biotechnology
Purinergics
Nitric oxide
Vasculature
Area (s) of CNPq: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::BIOQUIMICA::BIOLOGIA MOLECULAR
Language: por
Country: Brasil
Publisher: Universidade Federal de Uberlândia
Program: Programa de Pós-graduação em Biotecnologia
Quote: ARAÚJO, Bruna Juber de. Efeito do óxido nítrico sobre a atividade e expressão da ntpdase1 e da ecto-5'-nucleotidase em linhagens de células vasculares. 2019. 76f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Universidade Federal de Uberlândia, Patos de Minas, 2019. Disponível em: http://dx.doi.org/10.14393/ufu.di.2019.341
Document identifier: http://dx.doi.org/10.14393/ufu.di.2019.341
URI: https://repositorio.ufu.br/handle/123456789/25916
Date of defense: 15-Feb-2019
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