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Document type: Trabalho de Conclusão de Curso
Access type: Acesso Aberto
Title: Análise do comportamento in vitro entre uma cepa viscerotrópica e outra dermotrópica de Leishmania amazonensis
Alternate title (s): Analysis of the in vitro behavior between a viscerotropic strain and another dermotropic strain of Leishmania amazonensis
Author: Oliveira, Marco Miguel de
First Advisor: Silva, Sydnei Magno da
First member of the Committee: Alves, Cerces Luciana
Second member of the Committee: Araújo, Iasmin Aparecida Cunha
Summary: As leishmanioses são um complexo de doenças graves e negligenciadas causadas por protozoários do gênero Leishmania. As duas formas clínicas principais desta enfermidade são: leishmaniose cutânea (LC) e visceral (LV). Embora não seja frequente, algumas espécies causadoras de LC podem ser encontradas em células do sistema fagocitário mononuclear presentes em órgãos viscerais – como fígado e baço –, levando a um quadro clínico sugestivo de LV. O objetivo deste trabalho foi analisar o comportamento in vitro de uma cepa viscerotrópica de Leishmania amazonensis isolada do baço de um cão com sinais clínicos de LV e de outra cepa da mesma espécie (MHOM/BR/1989/Ba199). O desenvolvimento e a multiplicação das formas promastigotas foi avaliado por meio da curva de crescimento gerada com base no número de parasitos/mL. Resumidamente, os parasitos foram cultivados em meio quimicamente definido α-MEM e incubados a 24±1°C, sendo as culturas acompanhadas durante 7 dias. Com o intuito de verificar as porcentagens de promastigotas metacíclicas in vitro, as cepas foram incubadas (37ºC por 1h) com 10% (cepa viscerotrópica) e 8% (Ba199) de soro humano, sendo a viabilidade das formas resistentes a lise medida pelo ensaio de redução da resazurina. Para a infecção de macrófagos, 5x105 BMDMs foram cultivados em placas de 24 poços (5% de CO2 e 95% de umidade) contendo lamínulas (13mm). Em seguida, promastigotas de fase estacionária foram adicionadas aos poços, sendo a placa incubada a 26ºC por 18h. Após a lavagem, as células infectadas foram novamente incubadas a 37ºC por 12h. Posteriormente, as lamínulas foram retiradas dos poços, coradas com Panótico rápido, montadas em lâminas e analisadas por microscopia óptica. No segundo dia de crescimento, ambas as cepas iniciaram a fase exponencial, sendo o pico de promastigotas/mL registrado no quarto dia. A partir desse dia, a proliferação diminuiu dando início a fase estacionária e, posteriormente, a fase de declínio. O perfil das curvas foi semelhante, entretanto o número de promastigotas/mL variou entre as cepas do segundo ao sétimo dia (p<0,05). As porcentagens de promastigotas resistentes à proteínas séricas do Complemento foram próximas para ambas as cepas. Entretanto, constatou-se um aumento médio de aproximadamente 1,3× na quantidade de parasitos viáveis (resistentes) entre as fases de crescimento testadas (exponencial e estacionária), embora não existam diferenças estatísticas (p>0,9 ̅). A porcentagem de macrófagos infectados foi aproximadamente 2× maior para a cepa viscerotrópica do que para Ba199 (p=0,1). O índice de infecção encontrado para a cepa viscerotrópica também foi 3× maior do que o de Ba199 (p=0,1). A cepa viscerotrópica de aparentemente apresenta um comportamento in vitro similar ao de Ba199, embora ela possua uma maior capacidade de infectar a linhagem de macrófagos utilizados, o que pode ser um indicativo da expressão de determinados fatores de virulência por parte deste parasito.
Abstract: Leishmaniasis is a complex of serious and neglected diseases caused by protozoa of the genus Leishmania. The two main clinical forms of this disease are: cutaneous leishmaniasis (LC) and visceral (LV). Although not frequent, some LC-causing species can be found in cells of the mononuclear phagocytic system present in visceral organs - such as liver and spleen - leading to a clinical picture suggestive of VL. The objective of this work was to analyze the in vitro behavior of a viscerotrope strain of Leishmania amazonensis isolated from the spleen of a dog with clinical signs of LV and another strain of the same species (MHOM / BR / 1989 / Ba199). The development and multiplication of the promastigote forms was evaluated by means of the growth curve generated on the basis of the number of parasites / ml. Briefly, the parasites were cultured in chemically defined α-MEM medium and incubated at 24 ± 1 ° C, and the cultures were monitored for 7 days. In order to verify the percentages of metacyclic promastigotes in vitro, the strains were incubated (37ºC for 1h) with 10% (viscerotropic strain) and 8% (Ba199) of human serum, the viability of resistant forms being measured by the assay reduction of resazurin. For macrophage infection, 5x105 BMDMs were cultured in 24-well plates (5% CO2) containing coverslips (13mm). Then, stationary phase promastigotes were added to the wells, and the plate was incubated at 26ºC for 18h. After washing, the infected cells were again incubated at 37 ° C for 12h. Subsequently, the coverslips were removed from the wells, stained with Panótico, mounted on slides and analyzed by light microscopy. On the second day of growth, both strains started the exponential phase, with the peak of promastigotes/mL recorded on the fourth day. From that day on, the proliferation decreased, giving rise to the stationary phase and, later, the phase of decline. The profile of the curves was similar, however the number of promastigotes / mL ranged between strains from the second to the seventh day (p <0.05). The percentages of promastigotes resistant to Complement serum proteins were close for both strains. However, an average increase of approximately 1.3 × in the amount of viable (resistant) parasites between the growth phases tested (exponential and stationary) was observed, although there were no statistical differences (p> 0.9 ̅). The percentage of infected macrophages was approximately 2× greater for the viscerotropic strain than for Ba199 (p = 0.1). The infection rate found for the viscerotropic strain was also 3 × greater than that of Ba199 (p = 0.1). The viscerotropic strain apparently exhibits an in vitro behavior similar to that of Ba199, although it has a greater ability to infect the lineage of macrophages used, which may be indicative of the expression of certain virulence factors by this parasite.
Keywords: Visceralização
Infectividade
Metaciclogênese
Visceralization
Infectivity
Metacyclogenesis
Area (s) of CNPq: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::PARASITOLOGIA
Language: por
Country: Brasil
Publisher: Universidade Federal de Uberlândia
Quote: OLIVEIRA, M. M. Análise do comportamento in vitro entre uma cepa viscerotrópica e outra dermotrópica de Leishmania amazonensis. 2017. 61 f. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Ciências Biológicas) - Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 2017.
URI: https://repositorio.ufu.br/handle/123456789/20578
Date of defense: 13-Dec-2017
Appears in Collections:TCC - Ciências Biológicas (Uberlândia)

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