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metadata.dc.type: Dissertação
metadata.dc.rights: Acesso Aberto
Title: Estudo da interação da metaloprotease BmooMPα-I, isolada da peçonha de Bothrops moojeni (HOGE, 1965; Viperidae),com a citocina pró-inflamatória TNF-α.
metadata.dc.creator: Silva, Maraisa Cristina
metadata.dc.contributor.advisor1: Mineo, Jose Roberto
metadata.dc.contributor.advisor-co1: Oliveira, Fábio de
metadata.dc.contributor.advisor-co2: Mineo, Tiago Wilson Patriarca
metadata.dc.contributor.referee1: Silva, Neide Maria da
metadata.dc.contributor.referee2: Gomes, Roseli Aparecida da Silva
metadata.dc.description.resumo: A inflamação é um processo essencial para manutenção da homeostase, envolvendo eventos vasculares, migração e ativação de leucócitos. No entanto, suas manifestações exacerbadas, geralmente mediadas pelo aumento do nível de citocinas pró-inflamatórias como o fator de necrose tumoral (TNF-α), podem resultar em doenças crônicas, como artrite reumatoíde, fibrose pulmonar e reações de hipersensibilidade. O presente estudo teve por objeto avaliar se a enzima BmooMPα-I, uma metaloprotease isolada da peçonha de Bothrops moojeni, apresenta algum papel na resposta inflamatória em modelos experimentais in vitro e in vivo. Foi realizado o isolamento da enzima BmooMPα-I, a partir da peçonha bruta da serpente Bothrops moojeni, utilizando colunas de cromatografia DEAE Sephacel, Sephadex G-75 e Benzamidina-Sepharose. A eletroforese bidimensional (2D) demonstrou grau de pureza, massa molecular (Mr) e ponto isoelétrico (pI) de um trímero proteíco em condições redutoras (~23,6 kDa; ~21,2 kDa e ~18,7 kDa; pI na faixa de 7,24 a 7,33) e em condições não redutoras somente um spot protéico pode ser evidenciado (~23,0 kDa; pI 6,82). Foi realizado a imunização de coelhos da raça nova Zelândia para obtenção de anticorpos policlonais da classe IgG anti-BmooMPα-I. O ensaio imunoenzimático indireto (iELISA) confirmou a presença dos anticorpos IgG policlonais anti-BmooMPα-I no soro dos animais imunizados. Suas especificidade e reatividade cruzada com os antígenos (enzima BmooMPα-I e peçonha bruta de B. moojeni) foram confirmadas por Immunoblot 1D. Os anticorpos policlonais anti-BmooMPα-I neutralizaram a atividade azoproteolítica induzida pela peçonha bruta de B. moojeni e enzima pura (BmooMPα-I) em 27% e 100%, respectivamente, na razão 1:15 (m/m). Camundongos BALB/c na presença da metaloprotease BmooMPα-I exibiram uma redução na migração de leucócitos para a cavidade peritoneal, sugerindo um perfil de resposta anti-inflamatória. Os níveis de TNF-α determinados pelo método de ELISA foram reduzidos significativamente na presença da enzima BmooMPα-I, sugerindo que a mesma exerce uma ação proteolítica sobre o TNF-α, que foi confirmada pelo desaparecimento desta citocina dentre o perfil de bandas proteícas no SDS-PAGE. O ensaio com macrófagos ativados com agonistas de PRRs, demostrou uma redução níveis de TNF-α secretado pelos macrófagos após o seu tratamento com a enzima BmooMPα-I. Em conclusão, a enzima BmooMPα-I apresenta um perfil antiinflamatório de reposta imunológica, resultante da sua ação direta sobre a citocina pró-inflamatória TNF-α.
Abstract: Inflammation is an essential process for maintaining homeostasis, involving vascular events, migration and activation of leukocytes. However, its manifestations exacerbated, usually mediated by increased levels of TNF-α, can result in chronic diseases such as rheumatoid arthritis, pulmonary fibrosis and hypersensitivity reactions. The present study aimed to assess whether the enzyme BmooMPα-I, a metalloprotease isolated from the venom of Bothrops moojeni, could play any role in the inflammatory response in experimental models in vitro and in vivo. We carried out the isolation of the enzyme BmooMPα-I from crude venom of the Bothrops moojeni, using DEAE Sephacel column chromatography, Sephadex G-75 and Benzamidine-Sepharose. The 2D electrophoresis showed purity, molecular mass (Mr) and isoelectric point (pI) of a proteic trimer under reducing conditions (~23.6 kDa, ~ 21.2 kDa and ~18.7 kDa, pI in the range of 7.24-7.33) and nonreducing conditions only one spot protein can be demonstrated (~23.0 kDa; pI 6.82). Immunization was performed in New Zealand rabbits to obtain polyclonal IgG anti-BmooMPα-I, enzyme immune assay (iELISA) confirmed the presence of polyclonal IgG anti-BmooMPα-I in serum of immunized rabbits. Their specificity and cross reactivity with antigens (enzyme BmooMPα-I and crude venom of B. moojeni) was confirmed by immunoblot 1D. The polyclonal antibody anti-BmooMPα-I neutralized azoproteolytic activity induced by crude venom of B. moojeni and pure enzyme (BmooMPα-I) in the 27% and 100%, respectively, in 1:15 (w/w) ratios. BALB/c mice in the presence of the metalloproteinase BmooMPα-I exhibited a reduction in leukocyte migration into the peritoneal cavity, suggesting a profile of anti-inflammatory response. The levels of TNF-α determined by ELISA were significantly reduced in the presence of the enzyme BmooMPα-I, suggesting that it exerts a proteolytic role on TNF-α, which was confirmed by the disappearance of the its bands on SDS-PAGE profile. Further, experiments done with activated macrophages PRRs agonists demonstrated a reduction of TNF-α secreted by macrophages after treatment with the enzyme BmooMPα-I. In conclusion, the enzyme BmooMPα-I presents a profile of anti-inflammatory immune response, resulting from direct action on the pro-inflammatory cytokine TNF-α.
Keywords: Bothrops moojeni
BmooMP&#945
-I
TNF-&#945
Anticorpos policlonais
Macrófagos derivados de médula óssea (BMDMs)
Polyclonal antibodies
Bone marrow-derived macrophages (BMDMs)
metadata.dc.subject.cnpq: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::IMUNOLOGIA::IMUNOLOGIA APLICADA
metadata.dc.language: por
metadata.dc.publisher.country: BR
Publisher: Universidade Federal de Uberlândia
metadata.dc.publisher.initials: UFU
metadata.dc.publisher.department: Ciências Biológicas
metadata.dc.publisher.program: Programa de Pós-graduação em Imunologia e Parasitologia Aplicadas
Citation: SILVA, Maraisa Cristina. Estudo da interação da metaloprotease BmooMPα-I, isolada da peçonha de Bothrops moojeni (HOGE, 1965; Viperidae),com a citocina pró-inflamatória TNF-α.. 2012. 97 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas) - Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 2012.
URI: https://repositorio.ufu.br/handle/123456789/16681
Issue Date: 29-Jun-2012
Appears in Collections:DISSERTAÇÃO - Imunologia e Parasitologia Aplicadas

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