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https://repositorio.ufu.br/handle/123456789/15715| Document type: | Tese |
| Access type: | Acesso Aberto |
| Title: | Caracterização funcional e estrutural de novas proteases isoladas da peçonha de Bothrops alternatus e do látex de Euphorbia milii var. hislopii |
| Author: | Costa, Júnia de Oliveira |
| First Advisor: | Silva, Nilson Penha |
| First member of the Committee: | Oliveira, Fábio de |
| Second member of the Committee: | Soares, Andreimar Martins |
| Third member of the Committee: | Souza, Guilherme Rocha Lino de |
| Fourth member of the Committee: | Marcussi, Silvana |
| Fifth member of the Committee: | Borges, Márcia Helena |
| Summary: | CAPÍTULO II: Uma serinoprotease da peçonha de Bothrops alternatus foi isolada por meio de três etapas cromatográficas: DEAE Sephacel, Sephadex G-75 e Benzamidina-Sepharose. A enzima purificada, denominada balternina, apresentou uma única banda protéica quando analisada em SDS-PAGE, eletroforese em gel de poliacrilamida sob condições desnaturantes, apresentando peso molecular de aproximadamente 31.500 e 27.000 na presença e na ausência de agente redutor, respectivamente. O cDNA completo foi obtido por RT-PCR e a proteína madura de 236 resíduos de aminoácidos foi codificada por 708 pares de bases. O alinhamento múltiplo das sequências de aminoácidos deduzidas desta enzima mostrou similaridade estrutural com outras serinoproteases de peçonhas de serpentes. A balternina apresentou atividades fibrinogenolítica e albuminolítica. Quando a protease e o fibrinogênio bovino foram incubados a 37 °C, na proporção de 1:10 (m/m), a enzima clivou preferencialmente a cadeia Aα e, aparentemente, não degradou as cadeias Bβ e do substrato. Testes de estabilidade mostraram que o intervalo ótimo de temperatura e pH para a atividade proteolítica sobre o fibrinogênio foram de 30 a 40 °C e 7,0 a 8,0, respectivamente. O efeito de inibidores enzimáticos mostrou que a benzamidina inibiu a atividade fibrinogenolítica, indicando que a balternina é uma serinoprotease. A enzima isolada causou, ainda, alterações morfológicas no coração, fígado, pulmão e músculo de camundongos, desencadeando também coagulação in vitro e desfibrinogenação in vivo, quando administrada intraperitonealmente em camundongos, sugerindo ser uma enzima thrombin-like . Desta forma, a balternina pode ser de interesse como agente terapêutico na prevenção e tratamento de desordens trombóticas. CAPÍTULO III: A protease, designada de eumilina, foi isolada do látex de Euphorbia milii var. hislopii pela combinação de duas etapas cromatográficas: troca iônica (DEAE-Sephacel) e filtração em gel (Sephadex G-75). A eumilina é uma proteína monomérica com massa molecular aparente de 30 kDa quando analisada em SDS-PAGE sob condições redutoras e apresentou um pico principal de 29,814 kDa em espectrometria de massa MALDI-TOF/TOF. A eumilina apresentou atividades caseinolítica e fibrinogenolítica, mas não desencadeou atividade hemorrágica ou desfibrinogenante. Esta protease hidrolisa preferencialmente a cadeia A do fibrinogênio e, mais lentamente, a cadeia B. A atividade fibrinogenolítica foi inibida por b-mercaptoetanol e leupeptina. Em contraste, o EDTA e a benzamidina não afetaram a referida atividade. A ação proteolítica da eumilina sobre a caseína apresentou pH ótimo igual a 8,0 e foi estável em solução até 40 °C; perdendo completamente a atividade em temperatura 80 °C. A injeção Intraplantar de eumilina (1 25 μg/pata) causou hiperalgesia dose e tempodependente, com pico entre 1 a 5 h após injeção de enzima. Da mesma forma, causou resposta edematogênica máxima após 1 h. A análise morfológica indicou que a eumilina induziu mionecrose intensa, com infiltrado leucocitário e danos em células musculares cerca de 24 h após a injeção. CAPÍTULO IV: A balternina e a eumilina são proteases extraídas da peçonha da serpente Bothrops alternatus e do látex de Euphorbia milii var. hislopii, respectivamente. As estabilidades da balternina e da eumilina contra a desnaturação pelo calor e por uréia foram determinadas e comparadas entre si. A protease vegetal mostrou-se mais resistente quando aquecida em altas temperatutas e também quando submetida à ação da uréia como desnaturante. Novos estudos serão importantes para melhor caracterizar as condições necessárias para estabilização dessas enzimas, especialmente aquelas relacionadas com as estratégias de proteção relacionadas ao transporte e estocagem nos processos comercial, terapêutico e biotecnológico. |
| Abstract: | CHAPTER II: A protease, which we designate Eumiliin, was isolated from the latex of Euphorbia milii var. hislopii by a combination of ion-exchange chromatography using DEAE-Sephacel and gel filtration with Sephadex G-75. Eumiliin is a monomeric protein with an apparent molecular mass of 30 kDa by SDS PAGE under reducing conditions and gave one main peak at 29814 kDa in MALDITOF/ TOF mass spectrometry. Eumiliin has caseinolytic and fibrinogenolytic activities, but no hemorrhagic or defibrinating activities. The enzyme readily hydrolyzes the Aα-chain of fibrinogen and, more slowly, the Bß-chain. Its fibrinogenolytic activity is inhibited by b-mercaptoethanol and leupeptin. In contrast, EDTA and benzamidine did not affect the activity of Eumiliin. The caseinolytic activity of Eumiliin had a pH optimum of 8.0 and was stable in solution at up to 40 °C; activity was completely lost at 80 °C. Intraplantar injection of Eumiliin (1 25 μg/paw) caused a dose- and time-dependent hyperalgesia, which peaked 1 - 5 h after enzyme injection. Intraplantar injection of Eumiliin (1 25 μg/paw) also caused an oedematogenic response that was maximal after 1 h. Morphological analyses indicated that Eumiliin induced an intense myonecrosis, with visible leukocyte infiltrate and damaged muscle cells 24 h after injection. CHAPTER III: A protease, which we designate Eumiliin, was isolated from the latex of Euphorbia milii var. hislopii by a combination of ion-exchange chromatography using DEAE-Sephacel and gel filtration with Sephadex G-75. Eumiliin is a monomeric protein with an apparent molecular mass of 30 kDa by SDS PAGE under reducing conditions and gave one main peak at 29814 kDa in MALDITOF/ TOF mass spectrometry. Eumiliin has caseinolytic and fibrinogenolytic activities, but no hemorrhagic or defibrinating activities. The enzyme readily hydrolyzes the A-chain of fibrinogen and, more slowly, the B-chain. Its fibrinogenolytic activity is inhibited by b-mercaptoethanol and leupeptin. In contrast, EDTA and benzamidine did not affect the activity of Eumiliin. The caseinolytic activity of Eumiliin had a pH optimum of 8.0 and was stable in solution at up to 40 °C; activity was completely lost at 80 °C. Intraplantar injection of Eumiliin (1 25 μg/paw) caused a dose- and time-dependent hyperalgesia, which peaked 1 - 5 h after enzyme injection. Intraplantar injection of Eumiliin (1 25 μg/paw) also caused an oedematogenic response that was maximal after 1 h. Morphological analyses indicated that Eumiliin induced an intense myonecrosis, with visible leukocyte infiltrate and damaged muscle cells 24 h after injection. CHAPTER IV: Bhalternin and Eumiliin are proteases extracted from the venom of Bothrops alternatus and latex of Euphorbia milli var. hislopii, respectively. The stabilities of Bhalternin and Eumiliin against denaturation by heat and urea were determined and compared. The plant protease proved to be tougher when heated at high temperatures and also when subjected to the action of urea as denaturant. Further studies are needed to better characterize the conditions for stabilization of these enzymes, especially those related to the strategies needed to protect the transport and storage in the commercial, therapeutic and biotechnological processes. |
| Keywords: | Cobra venenosa - Veneno Bothrops Bothrops alternatus Peçonha de serpente Fibrinogenase Desfibrinogenação Euphorbia milii Crown-of-Thorns Euphorbiaceae Cysteine protease Eumiliin |
| Area (s) of CNPq: | CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::GENETICA |
| Language: | por |
| Country: | BR |
| Publisher: | Universidade Federal de Uberlândia |
| Institution Acronym: | UFU |
| Department: | Ciências Biológicas |
| Program: | Programa de Pós-graduação em Genética e Bioquímica |
| Quote: | COSTA, Júnia de Oliveira. Caracterização funcional e estrutural de novas proteases isoladas da peçonha de Bothrops alternatus e do látex de Euphorbia milii var. hislopii. 2010. 144 f. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas) - Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 2010. |
| URI: | https://repositorio.ufu.br/handle/123456789/15715 |
| Date of defense: | 17-Jun-2010 |
| Appears in Collections: | TESE - Genética e Bioquímica |
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