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https://repositorio.ufu.br/handle/123456789/30316
Tipo do documento: | Dissertação |
Tipo de acesso: | Acesso Aberto |
Título: | Fatores neutralizantes das atividades coagulante e hemorrágica da peçonha bruta de B.moojeni no soro da mesma espécie |
Título(s) alternativo(s): | Neutralizing factors of coagulant and hemorrhagic activities of B.moojeni crude venom in serum of the same species |
Autor(es): | Lopes, Willian Bráulio |
Primeiro orientador: | Hamaguchi, Amélia |
Resumo: | Alterações no sistema hemostático, como hemorragias e alterações na cascata de coagulação constituem os principais eventos decorrentes do envenenamento por serpentes do gênero Bothrops. A hemorragia é provocada por metaloproteases presentes no veneno das serpentes. Alguns animais possuem resistência natural aos efeitos nocivos do veneno de serpentes. Esta resistência pode ser explicada, na maioria das vezes, pela presença de fatores neutralizantes presentes no soro destes animais. O trabalho foi subdivido em dois capítulos. O objetivo do capítulo 1 foi identificar a presença de inibidores da atividade coagulante e hemorrágica presentes no soro da serpente Bothrops moojeni. E o objetivo do capítulo 2 foi isolar um inibidor de hemorraginas presente no soro de B. moojeni utilizando-se metodologia de purificação já estabelecida para um inibidor de metaloprotease, Bj46a. No capítulo 1, o soro foi aplicado em coluna Q-Sepharose (9,5 x 2,0 cm) previamente equilibrada com tampão Bicarbonato de Amônio 0,05M pH8,0. A eluição foi realizada utilizando-se o mesmo tampão em “stepwise” nas seguintes concentrações (0.2/0.35/0.5M), resultando em 8 picos. Os picos F2 (tubosl4-16) e F6 (tubos 46-51) neutralizaram a atividade hemorrágica provocada pela peçonha bruta (1:10 m/m) e os picos F6 e F8 (tubos 71-75) neutralizaram a atividade coágulante (1:1 m/m). A fração F2 (30mg) foi recromatografada em coluna Q-Sepharose (9,5 x 2,0 cm), equilibrada com tampão Bicarbonato de Amônio 0,05M pH8,0. A eluição foi realizada utilizando-se o mesmo tampão em gradiente convexo de 0.2-0.5M, câmara de mistura de 80ml, em fluxo constante de 20ml/h, a temperatura ambiente, resultando em 3 picos F1Q2-F3Q2. O pico F2Q2 contem inibidores da atividade hemorrágica e o perfil eletroforético indicou migração de bandas semelhantes a um inibidor de metaloproteases de baixo peso molecular já descrito: Bj46a. No capítulo 2 o soro de B.moojeni foi precipitado com sulfato de amônio nas faixas de saturação: 0-40%; 40-60%; 60-80%; 80-100%. A fração 40-60% foi aplicada em uma coluna Hitrap Phenyl FíP (1,6 x 2,5 cm) previamente equilibrada com tampão fosfato de sódio 0.01M contendo sulfato de amônio 1M pH 7.0 A eluição foi realizada estabelecendo-se um gradiente salino linear decrescente até 100% de fosfato de sódio 0,lM pH 7,0 resultando em 7 pools: Bml-Bm7. O perfil eletroforético indicou a presença de bandas em tomo de 55kDa, semelhantes a Bj46a no pool Bm2. Bm2 foi submetida ao fracionamentoXI em HPLC coluna C4, fase reversa, resultando em um pico principal, identificado como Bml. Os resultados da espectrometria de massa e sequenciamento aminoterminal de 14 resíduos comprovam a presença do inibidor de metaloprotease. |
Abstract: | Changes in the hemostatic system, such as hemorrhages and changes in the coagulation cascade, are the main events resulting from poisoning by Bothrops snakes. Hemorrhage is caused by metalloproteases present in snake venom. Some animals have natural resistance to the harmful effects of snake venom. This resistance can be explained, in most cases, by the presence of neutralizing factors present in the serum of these animals. The work was subdivided into two chapters. The objective of chapter 1 was to identify the presence of inhibitors of coagulant and hemorrhagic activity present in the serum of the snake Bothrops moojeni. And the objective of chapter 2 was to isolate a bleeding inhibitor present in the serum of B. moojeni using a purification methodology already established for a metalloprotease inhibitor, Bj46a. In chapter 1, the serum was applied to a Q-Sepharose column (9.5 x 2.0 cm) previously balanced with 0.05M pH 8.0 Ammonium Bicarbonate buffer. Elution was carried out using the same stepwise buffer in the following concentrations (0.2 / 0.35 / 0.5M), resulting in 8 peaks. Peaks F2 (tubesl4-16) and F6 (tubes 46-51) neutralized the hemorrhagic activity caused by the raw venom (1:10 m / m) and peaks F6 and F8 (tubes 71-75) neutralized clotting activity (1 : 1 m / m). The F2 fraction (30mg) was rechromatographed in a Q-Sepharose column (9.5 x 2.0 cm), equilibrated with 0.05M pH 8.0 Ammonium Bicarbonate buffer. Elution was performed using the same buffer in a 0.2-0.5M convex gradient, 80ml mixing chamber, at a constant flow of 20ml / h, at room temperature, resulting in 3 F1Q2-F3Q2 peaks. The F2Q2 peak contains inhibitors of hemorrhagic activity and the electrophoretic profile indicated migration of bands similar to a low molecular weight metalloprotease inhibitor already described: Bj46a. In Chapter 2, B.moojeni serum was precipitated with ammonium sulfate in the saturation ranges: 0-40%; 40-60%; 60-80%; 80-100%. The 40-60% fraction was applied to a Hitrap Phenyl FíP column (1.6 x 2.5 cm) previously balanced with 0.01M sodium phosphate buffer containing 1M ammonium sulfate pH 7.0 Elution was performed by establishing a saline gradient linear decreasing to 100% sodium phosphate 0.1M pH 7.0 resulting in 7 pools: Bml-Bm7. The electrophoretic profile indicated the presence of bands around 55kDa, similar to Bj46a in the Bm2 pool. Bm2 was subjected to fractionationXI in HPLC column C4, reverse phase, resulting in a main peak, identified as Bml. The results of mass spectrometry and amino acid sequencing of 14 residues confirm the presence of the metalloprotease inhibitor. |
Palavras-chave: | Caissaca (Cobra) Inibidores de metaloproteinases Inibidores Cobra venenosa |
Área(s) do CNPq: | CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::GENETICA |
Assunto: | Bothrops |
Idioma: | por |
País: | Brasil |
Editora: | Universidade Federal de Uberlândia |
Programa: | Programa de Pós-graduação em Genética e Bioquímica |
Referência: | LOPES, Williau Bráulio. Fatores neutralizantes das atividades coagulante e hemorrágica da peçonha bruta de B.moojeni no soro da mesma espécie. 2003. 69 f. Dissertação (Mestrado em Genética e Bioquímica) - Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 2020. DOI http://doi.org/10.14393/ufu.di.2003.60 |
Identificador do documento: | http://doi.org/10.14393/ufu.di.2003.60 |
URI: | https://repositorio.ufu.br/handle/123456789/30316 |
Data de defesa: | 2003 |
Aparece nas coleções: | DISSERTAÇÃO - Genética e Bioquímica |
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