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Document type: Dissertação
Access type: Acesso Embargado
Title: Neurobiologia das reações de defesa: avaliação celular e comportamental de camundongos submetidos ao teste de exposição ao rato
Alternate title (s): Neurobiology of defensive reactions: cellular and behavioral evaluation of mice submitted to the rat exposure test
Author: Queiroz, Rafaella Misael
First Advisor: Miguel, Tarciso Tadeu
First coorientator: Cruz, Fabio Cardoso
First member of the Committee: Neiro, Érika Renata Barbosa
Second member of the Committee: Souza, Ricardo Luiz Nunes de
Summary: Amídala (AMY) e Matéria Cinzenta Periaquedutal (MCP), são importantes estruturas do sistema encefálico aversivo responsável por mediar reações de defesa em animais frente a estímulos aversivos. Sendo assim, objetivo do trabalho foi avaliar a ativação neuronal da área encefálica AMY e MCP, bem como a resposta da inativação da MCP e a atuação do neurotransmissor fator liberador de corticotrofina (CRF – do inglês “corticotropin-releasing factor”) e a via proteína quinase A (PKA) intra MCP nas respostas comportamentais de camundongos Suíços machos (30-40g) - (Comitê de ética: n°100/14/UFU) expostos ao Teste de Exposição ao Rato (TER). Para avaliar a resposta celular intra AMY e MCP verificaram-se as alterações na expressão da proteína Fos, um importante indicador de atividade neuronal. Para isso os animais foram submetidos ao TER por 10 minutos, expostos ao seu predador rato ou brinquedo (rato de pelúcia), por uma vez (protocolo agudo) ou cinco (dias intercalados, protocolo repetido), enquanto o grupo controle não foi exposto. Após o teste, os animais foram sacrificados e os encéfalos processados por imuno-histoquímica para Fos com base no protocolo desenvolvido pelo Laboratório de Neurociências e Comportamento-UNIFESP. O número de células Fos-positivas foi avaliado no software ImageJ e expresso como média±EPM, sendo significativo quando p<0,05. Para avaliar as respostas comportamentais foram implantadas cânulas guias na MCP dos camundongos e, após recuperação, foram realizadas microinjeções de veículo (Salina) ou fármacos, conforme os experimentos realizados. Dessa forma, no primeiro experimento foi utilizado muscimol (agonista GABA A; dose: 0,06nmol) + baclofeno (agonista GABA B; dose: 0,6nmol) - MB, no segundo, o H89 (inibidor da PKA; doses: 2,5nmol ou 5,0nmol) e no terceiro o CP 376395 (antagonista CRF1; doses: 1,5nmol ou 3,0nmol) e expostos ao rato no TER por 10 minutos. Os testes foram gravados, os comportamentos avaliados e expressos como média±EPM, considerando significativo quando p<0,05. Os resultados não indicaram diferença significativa de Fos-positivas intra AMY, considerando seu núcleo basolateral. Contudo, camundongos expostos ao rato apresentaram maior número de células que expressaram Fos intra MCP, porção dorsal, quando comparados ao grupo brinquedo e controle, tanto no teste agudo, quanto no repetido. Além disso, quando comparadas entre si, a exposição repetida induziu maior expressão de Fos que a exposição aguda indicando uma possível diferença na modulação da MCPd frente ao estresse repetido e agudo. A análise do comportamento indicou que os camundongos expostos ao rato apresentaram tendência (p = 0,09) à significância na redução do tempo de permanência na área mais aversiva do TER (desprotegida) e expressaram significativamente menor tempo de escalada e contato com a tela no grupo de exposições repetidas e tendência à diminuição do contato no grupo de exposição única (p = 0,07). Os números e os tempos de esticadas também foram ou tenderam a ser (p = 0,06) alterados quando comparamos exposição ao rato ou brinquedo. O tratamento intra MCP com MB aumentou o tempo de permanência dos camundongos na área mais aversiva do aparato e diminuiu ou tendeu a diminuir a exibição de comportamentos de avaliação de risco. Podemos verificar também que microinjeção de CP intra MCP de camundongos foi ansiolítico, pois houve uma elevação do tempo de permanência dos animais na área desprotegida do TER (dose: 1,5 nmol), efeito observado também com tratamento com H89, na dose de 5,0 nmol. Portanto, os resultados permitem sugerir um envolvimento da MCP, do neurotransmissor CRF e da via PKA na modulação das respostas de defesas em camundongos expostos ao TER. Além disso, parece existir diferença na modulação do estresse repetido e agudo, já que a exposição repetida induziu maior ativação neuronal intra MCPd.
Abstract: Brain areas, such as amygdala (AMY) and periaqueductal gray (PAG), are important structures of the aversive brain system responsible for mediating defense reactions in animals against aversive stimuli. Therefore, the objective of this study was to evaluate the neuronal activation of the AMY and PAG brain area, as well as the importance of inactivation of PAG and the action of neurotransmitter corticotrophin releasing factor (CRF) and the intracellular protein kinase A (PKA) pathway in the behavioral responses of male Swiss mice (30-40g; Ethics Committee: n ° 100/14/UFU) exposed to the Rat Exposure Test (RET). To assess the cellular response with in AMY and PAG, we have checked for changes in Fos protein expression, an important indicator of neuronal activity. For this, the animals were submitted to RET for 10 minutes, exposed to their predator rat (alive) or toy rat (plush rat) for once (acute) or five (interleaved days, repeated), while the control group was not exposed. After test, animals were sacrificed and its brains processed by immunohistochemistry for Fos based on the protocol developed by the Laboratory of Neurosciences and Behavior-UNIFESP. The number of Fos-positive cells was evaluated in ImageJ software and expressed as mean ± SEM, being significant when p < 0.05. To evaluate the behavioral responses, guideline cannula were implanted into the PAG of the mice and microinjections of vehicle (Salina) or drugs were carried out according to experiment. Experiment 1, muscimol (agonist GABA A; dose: 0.06nmol) + baclofen (GABA B agonist; dose: 0.6nmol), MB; experiment 2, H89 (PKA inhibitor, doses: 2.5nmol or 5.0nmol) and experiment 3, CP 376395 (CRF1 antagonist; doses: 1.5nmol or 3.0nmol) and exposed to RET for 10minutes. Tests were recorded, behaviors evaluated and expressed as mean ± SEM, considering significant when p < 0.05. Results did not indicate any significant difference of Fos-positive intra AMY. However, mice exhibited higher numbers of cells expressing Fos intra PAG when compared to the toy and control groups, both in the acute and repeated tests. In addition, when compared to each other, repeated exposure induced greater Fos expression than acute exposure indicating a possible difference in PAG modulation against repeated and acute stress. Behavioral analysis indicated that the mice exposed to the rat showed a tendency to the significance in the reduction of the time spent in the most aversive area of the RET (surface, unprotected area), significant less time climbing and contact with wire mesh screen in a group of repeated exposures and a strong tendency to decrease contact in a single exposure group (p = 0.07). Frequency and time of stretched attend posture were also altered or strongly tended to be altered (p = 0.06) when we compared exposure to the rat or toy rat. Intra PAG mouse treatment with MB increased the time spent on the most aversive area of the apparatus and decreased or tended to decrease the display of risk assessment behaviors. We also verified that microinjection of CP intra PAG of mice promoted anxiolytic-like effect, since there was an increase in the time spent of the animals in the unprotected area of the RET (dose: 1.5 nmol), an effect also observed with treatment with H89, at the dose of 5,0 nmol. Therefore, results suggest an involvement of the PAG, the CRF neurotransmitter and the PKA pathway in the modulation of the defensive responses in mice exposed to the RET. In addition, there seems to be a difference in the modulation of repeated and acute stress, since repeated exposure induced greater neuronal activation within PAG.
Keywords: Ansiedade
Amídala
Matéria cinzenta periaquedutal
GABA
CRF
PKA
Teste de exposição ao rato
Anxiety
Amygdala
Periaquedutal gray
GABA
CRF
PKA
Rat exposure test
Area (s) of CNPq: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::FARMACOLOGIA::NEUROPSICOFARMACOLOGIA
Language: por
Country: Brasil
Publisher: Universidade Federal de Uberlândia
Program: Programa de Pós-graduação em Biologia Celular e Estrutural Aplicadas
Quote: QUEIROZ, Rafaella Misael. Neurobiologia das reações de defesa: avaliação celular e comportamental de camundongos submetidos ao teste de exposição ao rato. 2017.80 f. Dissertação (Mestrado em Biologia Celular e Estrutural Aplicadas) - Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 2017.
Document identifier: http://dx.doi.org/10.14393/ufu.di.2018.68
URI: https://repositorio.ufu.br/handle/123456789/20707
Date of defense: 29-Sep-2017
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