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metadata.dc.type: Tese
metadata.dc.rights: Acesso Aberto
Title: Caracterização, imobilização e aplicação das lipases de candida rugosa e geotrichum candidum produzidas em meio contendo melaço de soja
metadata.dc.creator: Morais Júnior, Wilson Galvão de
metadata.dc.contributor.advisor1: Ribeiro, Eloízio Júlio
metadata.dc.contributor.advisor-co1: Resende, Miriam Maria de
metadata.dc.contributor.advisor-co2: Pessela, Benevides Costa
metadata.dc.contributor.referee1: Falleiros, Larissa Nayhara Soares Santana
metadata.dc.contributor.referee2: Vieira, Patricia Angelica
metadata.dc.contributor.referee3: Coutinho Filho, Ubirajara
metadata.dc.contributor.referee4: Dini, Carolina Merheb
metadata.dc.contributor.referee5: Borges, Wesley da Silva
metadata.dc.description.resumo: Lipases são enzimas que hidrolisam os ésteres de glicerol, são muitas vezes utilizadas em aplicações biotecnológicas e industrial. As lipases de Candida rugosa e Geotrichum candidum são conhecidas por terem características tais como ampla especificidade em substratos, tolerância em relação a solventes orgânicos e de elevada estabilidade térmica. Desta forma, o presente trabalho tem como objetivo geral caracterizar, imobilizar e aplicar as lipases de Candida rugosa e Geotrichum candidum produzidas em meio contendo melaço de soja. As massas moleculares determinadas por SDS-PAGE foram de 59,7 kDa para a lipase de C. rugosa e 38,3 kDa para a lipase de G. candidum. A lipase solúvel de ambos os microrganismos apresentaram atividade enzimática máxima a uma temperatura de 40 °C e foram inibidas a pH 10. O Km da lipase de C. rugosa foi de 200,53 μM e o Vmáx 0,044 μmol/min, a lipase de G. candidum apresentou um Km e Vmáx de 443,99 μM e 0,382 μmol/min, respectivamente. Ambas as lipases sofreram inibição apenas na presença do íon metálico Cu3+. A imobilização destas enzimas foi realizada por adsorção em Octil-Sefarose, ligação covalente unipontual em bromocianógeno (CNBr), ligação iônica em Dietilaminoetil (DEAE), Monoaminoetil–N–Etil (MANAE), carboximetil e sulfopropil, e por ligação covalente multipontual em suporte heterogêneo aminoglioxil (AMG). Os derivados imobilizados foram caracterizados em relação ao pH, à estabilidade térmica e em solventes orgânicos. As lipases estudadas tiveram sua estabilidade melhorada quando comparada com a enzima solúvel. À 50ºC, a lipase de G. candidum imobilizada em AMG, manteve sua atividade em 90% durante 7 horas, e a lipase de C. rugosa imobilizada em CNBr apresentou maior estabilidade reduzindo 25,76% da atividade residual em 7 horas. As lipases estudadas imobilizadas em AMG teve a estabilidade melhorada resultando numa atividade residual superior a 95%, em pH 10. Quando comparados com a enzima solúvel, os derivados imobilizados nos suportes catiônicos carboximetil e sulfopropil (mais estáveis) foram até 6 vezes mais estáveis na presença de metanol, até 11 vezes mais estáveis na presença de metanol e até 10 vezes mais estável na presença de ciclohexano. Os derivados imobilizados foram aplicados na hidrólise do óleo de sardinha para produção de ácidos polinsaturados (PUFA) Omega-3. A lipase de C. rugosa (enzima solúvel e derivados imobilizados) apresentou maior seletividade (EPA/DHA) quando comparada à seletividade produzida pela lipase de G. candidum. Os derivados imobilizados em carboximetil e sulfopropil foram os que apresentaram maior seletividade, 11 para lipase de C. rugosa e 7 para a lipase de G. candidum. Quando aplicados na hidrólise enantiosseletiva do (R,S) – éster etílico de ácido mandélico, a lipase de C. rugosa imobilizada em AMG apresentou maior seletividade pelo isômero S em pH 5 e 7, já em pH 9 a maior seletividade foi pelo isômero R. A lipase de G. candidum quando imobilizada em CNBr e AMG, apresentou maior seletividade pelo isômero S em pH ácido e alcalino, e em pH neutro sua seletividade foi maior para isômero R. Quando imobilizada em DEAE, a lipase de G. candidum foi mais seletiva pelo isômero R em pH 5 e 7, e em pH 9 sua seletividade é maior pelo isômero S. O contrário acontece quando imobilizada em carboximetil. As técnicas de imobilização, bem como o suporte utilizado, é um método eficiente para enzimas, como lipases que sofrem alterações dramáticas na sua conformação durante a catálise, e podem alterar as propriedades catalíticas melhorando sua estabilidade térmica, com pH, em solventes orgânicos.
Abstract: Lipases are enzymes that hydrolyses the esters in glycerol, often used for biotechnological and industrial applications. Candida rugosa and Geotrichum candidum lipases are known to have characteristics such as broad substrate specificity, tolerance toward organic solvents and high thermal stability. Thus, the present work has the general objective to characterize, immobilize and apply the of lipase from C. rugosa and G. candidum produced in a culture medium composed of soybean molasses. The molecular weight determined by SDS-PAGE was 59.7 kDa for the C. rugosa lipase, and 38.3 kDa for the G. candidum lipase. The soluble lipase from both microorganisms show maximum enzymatic activity at a temperature of 40 °C and were inhibited at pH 10. The C. rugosa lipase Km was 200.53 μM and Vmax 0.044 μmol/min, the G. candidum lipase showed a Km and Vmax of 443.99 μM and 0.382 μmol/min, respectively. Both lipases suffer inhibition only in the presence of the metal ion Cu3+. The immobilization of these enzymes was performed by adsorption on Octyl-Sepharose, by covalent unipontual bond on Cyanogen bromide (CNBr), by ionic bond on Diethylaminoethyl (DEAE) ionic bond, Monoaminoethyl–N–Ethyl (MANAE), carboxymethyl and sulfopropyl, and by multipoint covalent attachment on heterogeneous support aminoglyoxyl (AMG). The derivatives immobilized were characterized in relation to pH, thermal stability and organic solvents effect. The lipases studied had their stability improved when compared to soluble enzyme. At 50 °C, the G. candidum lipase immobilized on AMG retained the activity at 90% for 7 hours, and C. rugosa lipase immobilized on CNBr was more stable reducing the residual activity in 25.76 % in 7 hours. The lipases studied immobilized on AMG had improved stability resulting in a residual activity higher than 95%, at pH 10. Compared to soluble enzymes, the derivatives immobilized on cationic supports carboxymethyl and sulfopropyl (more stable) were up to 6-fold more stable in the presence of methanol, up to 11-fold more stable in the presence of methanol and up to 10-fold more stable in the presence of cyclohexane. The immobilized derivatives were applied in hydrolysis of sardine oil for the production of polyunsaturated acids (PUFA) Omega-3. The lipase of C. rugosa (soluble and immobilized derivatives) showed higher selectivity (EPA/DHA) compared to the selectivity produzidade by G. candidum lipase. The derivatives immobilized on carboxymethyl and sulfopropyl were those with greater selectivity, 11 for C. rugosa lipase and 7 for G. candidum lipase. When applied in enantioselective hydrolysis of (R,S) - mandelic acid ethyl ester, the C. rugosa lipase immobilized on AMG showed higher selectivity for the S isomer at pH 5 and 7, already at pH 9 to increased selectivity was the isomer R. G. candidum lipase immobilized on CNBr and AMG, has greater selectivity for the S isomer at acid and alkaline pH, and at neutral pH is greater selectivity for isomer R. This enzyme immobilized on carboxymethyl has the opposite behavior when compared between the cationic and anionic supports. When immobilized on DEAE, G. candidum lipase is more selective for the isomer R at pH 5 and 7, and at pH 9 its selectivity is greater to isomer S. The opposite happens when immobilized on carboxymethyl. The immobilization techniques, as well as the support used, is an efficient method for enzymes, such as lipases which undergo dramatic changes in its conformation during catalysis, and may change the catalytic properties improving its stability with pH, thermal and in presence of organic solvents.
Keywords: Engenharia química
Lipase
Acidos graxos Omega-3
Hidrolise
Lipase microbiana
Candida rugosa
Geotrichum candidum
Imobilização
Estabilização
Produção de Omega-3
Hidrólise enantiosseletiva
Microbial lipase
Candida rugosa
Geotrichum candidum
Immobilization
Estabilization
Omega-3 production
Enantioselective hydrolysis
metadata.dc.subject.cnpq: CNPQ::ENGENHARIAS::ENGENHARIA QUIMICA
metadata.dc.language: por
metadata.dc.publisher.country: Brasil
Publisher: Universidade Federal de Uberlândia
metadata.dc.publisher.program: Programa de Pós-graduação em Engenharia Química
Citation: MORAIS JUNIOR, Wilson Galvão de. Caracterização, imobilização e aplicação das lipases de candida rugosa e geotrichum candidum produzidas em meio contendo melaço de soja. 2016. 107 f. Tese (Doutorado em Engenharia Química) - Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 2016.
URI: https://repositorio.ufu.br/handle/123456789/18086
Issue Date: 5-Jan-2017
Appears in Collections:TESE - Engenharia Química

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