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Document type: Dissertação
Access type: Acesso Aberto
Title: Caracterização bioquímica e funcional da lipase/esterase lesA secretada por Xanthomonas axonopodis pv. citri na doença do cancro cítrico
Author: Polloni, Lorraine Cristina
First Advisor: Nascimento, Rafael
First member of the Committee: Moreira, Leandro Marcio
Second member of the Committee: Zaini , Paulo Adriano
Summary: A proteína LesA é uma enzima do tipo α/β hidrolase codificada pelo gene XAC0501 em Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), agente causador do cancro cítrico. Análises in silico revelaram que o gene lesA codifica uma lipase/esterase ortóloga à enzima LipA, presente em diversas espécies do grupo das Xanthomonas. Este estudo teve como objetivo realizar a caracterização bioquímica da proteína LesA e determinar a sua importância na virulência de Xac. Para isso, mutantes de Xac para o gene lesA (ΔXac-LesA), foram obtidos e submetidos a caracterização de sua atividade lipásica e esterásica, onde apresentou significante redução em comparação com a cepa selvagem Xac str. 306 (Xac306wt). Com a finalidade de se constatar a importância da LesA na virulência e patogenicidade do microrganismo em estudo, folhas de citros foram inoculadas com ΔXac-LesA e Xac306wt. Os resultados demonstram que os mutantes foram capazes de causar danos teciduais, porém, em menor escala que a Xac306wt, possivelmente devido a ausência da atividade de LesA. Provavelmente, esta deficiência na patogênese de ΔXac-LesA pode ter sido causado pela ausência da expressão da LesA. Em seguida, se procedeu com as análises dos secretomas in planta (folhas de citros infectada com Xac306wt) e das três condições de meio de cultivo diferentes (meio que não induz a virulência, NB, e dois meios indutores de virulência XAM1 e XAM1-Ex), afim de identificar a LesA. Infelizmente, não constatamos a presença da LesA nos secretomas, contudo os dados encontrados oferecem novos insights sobre como ocorre a patogênese deste microrganismo e permitiu a identificação de uma série de fatores de virulência que podem ser importantes no desenvolvimento da doença. Posteriormente, se procedeu com a caracterização bioquímica das colônias de Xac306wt sob diferentes condições de cultivo in vitro, e observamos que a atividade lipásica foi maior nas colônias cultivadas em XAM1 e XAM1-Ex do que em NB. No entanto, a atividade esterásica não demonstrou o mesmo resultado. A partir da expressão de proteína LesA em E. coli DH5a, se confirmou a atividade de lipase/esterase desta enzima que provou ser capaz de ativar uma resposta de hipersensibilidade em Nicotiana tabacum. Em conclusão, propomos que LesA desempenha um papel importante na virulência do patógeno Xac, oferecendo novos insights sobre a patogênese deste microrganismo.
Abstract: LesA, from the citrus canker pathogen Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), is an α/β hydrolase fold protein with lipase/esterase function encoded by the gene XAC0501. In silico analysis revealed that LesA gene encodes a lipase/esterase orthologous to the LipA enzyme, which is present in several species of Xanthomonas. In this study, we aimed to biochemically characterize LesA, and to determine the importance of this protein in the virulence of Xac. A LesA mutant was generated, and lipase and esterase activities showed that it was significantly diminished in the lesA mutant compared with wild-type str. 306 (Xac306wt). If LesA is partially responsible for citrus canker symptoms, there should be spatial association of LesA with the leaf symptom. As a demonstration of the ability of LesA to induce symptoms, ΔXac-LesA and Xac306wt cells were pressure-infiltrated into citrus leaves. The mutants were able to induce local necrosis, but not as much as the Xac306wt. The ΔXac-LesA mutants may be deficient in pathogenesis due to the lack of LesA. Furthermore, with the aim of confirming the importance of the LesA protein on the virulence of Xac, we proceeded with a secretome analysis in planta (citrus leaf infected with Xac306wt) as well as under three different in vitro growth conditions. For the cultivation of bacteria, we used a virulence noninductive medium, NB, and two virulence-inductive media XAM1 and XAM1-Ex (XAM1 plus 30% of citrus leaf extract). Unfortunately, we could not identify the presence of the lipase/esterase LesA from the secretomes. The secretome analysis presented here offers, nonetheless, new insights into the pathobiology of this pathogen. This secretome enabled us to identify a series of putative virulence factors that might play important roles in the development of citrus canker. We proceeded with the biochemical characterization of Xac306wt grown under different in vitro conditions. Results showed that the lipase activity was higher in the cells grown under virulence-inductive medium than the non-inductive medium. Nevertheless, the esterase activity did not demonstrate the same result. We performed the recombinant expression of LesA protein in E. coli cells. The results confirmed the lipase/esterase activity of this enzyme. In addition, LesA was able to activate a hypersensitive response in Nicotiana tabacum. In conclusion, we propose that LesA may play an important role in the virulence of Xac.
Keywords: Atividade lipásica
Atividade esterásica
Secretoma
Resposta de hipersensibilidade
Lipase activity
Esterase activity
Secretome
LesA
Hypersensitive response
Bioquímica
Xanthomonas axonopodis
Lipase
Esterases
Area (s) of CNPq: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::GENETICA
Language: por
Country: Brasil
Publisher: Universidade Federal de Uberlândia
Program: Programa de Pós-graduação em Genética e Bioquímica
Quote: Polloni, Lorraine Cristina. Caracterização bioquímica e funcional da lipase/esterase lesA secretada por Xanthomonas axonopodis pv. citri na doença do cancro cítrico. 2016. 72 f. Dissertação (Mestrado em Genética e Bioquímica) - Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 2016.
URI: https://repositorio.ufu.br/handle/123456789/17906
Date of defense: 29-Jul-2016
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