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metadata.dc.type: Dissertação
metadata.dc.rights: Acesso Aberto
Title: NcROP4 como um marcador de fase crônica no sorodiagnóstico da infecção por Neospora caninum
metadata.dc.creator: Ramos, Eliézer Lucas Pires
metadata.dc.contributor.advisor1: Mineo, Tiago Wilson Patriarca
metadata.dc.contributor.referee1: Ferro, Eloisa Amália Vieira
metadata.dc.contributor.referee2: Garcia, João Luis
metadata.dc.description.resumo: Neospora caninum é um parasito intracelular obrigatório, capaz de causar doença em uma variedade de hospedeiros. Desde sua primeira descrição, a infecção por N. caninum tem emergido como uma importante doença em cães e bovinos em todo o mundo. Testes sorológicos como imunofluorescência indireta (RIFI) e ELISA são classicamente utilizados no diagnóstico da neosporose, sendo o primeiro considerado padrão ouro no sorodiagnóstico. Entretanto, ainda não há testes comerciais que visam avaliar o estágio da infecção, uma vez que os principais sinais clínicos são relatados durante a fase aguda ou reativação do parasito. Diversos alvos proteicos do patógeno vem sendo testados a fim de verificar a fase de infecção do hospedeiro, apresentando resultados satisfatórios, todavia, novos alvos devem ser avaliados para desenvolver um diagnóstico efetivo para os estágios da infecção. Desse modo, o presente trabalho objetivou avaliar o potencial da proteína NcROP4 de N. caninum como marcador de fase da infecção pelo protozoário. Para tanto, avaliou-se a expressão e localização de NcROP4 durante o processo de infecção em células HeLa para investigar a possível exposição da proteína a anticorpos. Posteriormente, análises de bioinformática e phage display foram desenvolvidas visando predizer e determinar os epítopos de células B da proteína. Camundongos e bovinos foram infectados experimentalmente a fim de investigar através de ensaios imunoenzimáticos indireto e reverso a produção de anticorpos IgG anti-NcROP4 durante a infecção. Observou-se que a proteína NcROP4 é secretada no citoplasma de células HeLa durante o processo de invasão, o que permite seu extravasamento para o ambiente extracelular após lise das células. Análises de bioinformática demonstrou que NcROP4 exibe 23 regiões que são potenciais epítopos de célula B e as análises de phage display constataram que o mAb 20D2 se liga a região de 360 400 aminoácidos da proteína. Certificou-se também que camundongos produzem anticorpos de alta avidez contra NcROP4 recombinante (rNcROP4) após 30 dias de infecção (fase crônica) e que não há diferença entre as subclasses de IgG (IgG1 e IgG2a) neste processo de reconhecimento. Além disso, anticorpos de bovinos infectados experimentalmente reconheceram rNcROP4 após 44 dias de infecção, caracterizando um reconhecimento de fase crônica. Observou-se ainda que NcROP4 é reconhecida somente durante reinfecção em ELISA reverso, no qual há o bloqueio de um epítopo da proteína. Desse modo, conclui-se que NcROP4 pode ser utilizada como marcador de fase crônica na infecção por N. caninum, sendo uma estratégia adicional no sorodiagnóstico da neosporose.
Abstract: Neospora caninum is an obligate intracellular parasite whick is able to infect a wide range of hosts. Since its first description, N. caninum has emerged as an important disease of cattle and dogs worldwide. The neosporosis diagnosis is classically performed by serological tests as indirect immunofluorescence (RIFI) and ELISA, being the first gold standard for serodiagnosis that aim to detect the presence of antibodies against the parasite. However, there are no commercial tests designed to assess the stage of infection, once the main clinical signs are reported during the acute phase or during infection reactivation. Several protein targets of this pathogen has been tested in order to check the phase of host infection with satisfactory results. However, new targets should be evaluated in order to develop an effective diagnostic for the stages of infection. Thus, the present study aimed to studied the potential of NcROP4 protein as a stage marker of N. caninum infection. For this purpose, we evaluated the expression and localization of NcROP4 during infection in HeLa cells to investigate the possible exposure of this protein to antibodies. Subsequently, bioinformatic analysis and phage display were developed aiming to predict and determine B cell epitopes of the NcROP4. Mice and cattle were experimentally infected to investigate the producing of IgG through indirect and reverse immunoenzyme assay against NcROP4 during infection. It was observed that the NcROP4 protein is secreted into the cytoplasm of HeLa cells during the invasion process, which allows its extravasation to the extracellular environment after cell lysis. Bioinformatics analysis showed that NcROP4 displays 23 regions that are potential B-cell epitopes and analysis of phage display have showed that mAb 20D2 binds to the region 360-400 amino acids of this protein. Also made sure that mice produce high avidity antibodies against recombinant NcROP4 (rNcROP4) after 30 days of infection (chronic phase) and that there is no difference between the IgG subclass (IgG1 and IgG2) in this recognition process. Moreover, experimentally infected cattle recognize rNcROP4 after 44 days of infection, featuring the recognizing of chronic phase. It was also observed that NcROP4 is recognized only during reinfection in reverse ELISA, in which there is the block an epitope of the protein. Thus, it is concluded that NcROP4 can be used as chronic phase marker during N. caninum infection, being an additional strategy in the serodiagnosis of neosporosis.
Keywords: Protozoário
Sorodiagnóstico
Proteínas
Infecção
NcROP4
Sorodiagnóstico e N. caninum
Serodiagnosis and N. caninum
metadata.dc.subject.cnpq: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::IMUNOLOGIA::IMUNOLOGIA APLICADA
metadata.dc.language: por
metadata.dc.publisher.country: BR
Publisher: Universidade Federal de Uberlândia
metadata.dc.publisher.initials: UFU
metadata.dc.publisher.department: Ciências Biológicas
metadata.dc.publisher.program: Programa de Pós-graduação em Imunologia e Parasitologia Aplicadas
Citation: RAMOS, Eliézer Lucas Pires. NcROP4 como um marcador de fase crônica no sorodiagnóstico da infecção por Neospora caninum. 2014. 92 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas) - Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 2014.
URI: https://repositorio.ufu.br/handle/123456789/16705
Issue Date: 25-Jul-2014
Appears in Collections:DISSERTAÇÃO - Imunologia e Parasitologia Aplicadas

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