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Document type: Tese
Access type: Acesso Aberto
Title: Avaliação dos níveis de anticorpos, citocinas e mirnas em pacientes com rinite mediada e não mediada por anticorpos IgE
Author: Miranda, Juliana Silva
First Advisor: Taketomi, Ernesto Akio
First member of the Committee: Gomes, Matheus de Souza
Second member of the Committee: Goulart Filho, Luiz Ricardo
Third member of the Committee: Ferreira-briza, Fátima
Fourth member of the Committee: Almeida, Karine Cristine de
Summary: A rinite alérgica é uma doença com padrão de resposta clássico que apresenta sintomatologia e IgE (S-IgE+), caracterizada por inflamação das vias aéreas superiores regulada pelo perfil Th2. Contudo, existe outro quadro de rinite que também apresenta sintomatologia desencadeada por exposição a poeira domiciliar, mas sem a presença de IgE (S-IgE-) sistêmica, demonstrando um mecanismo independente de IgE envolvido e ainda não compreendido. Os objetivos do presente trabalho foram investigar a resposta anticórpica ao ácaro da poeira domiciliar Dermatophagoides pteronyssinus (Dp), os níveis de citocinas e a expressão relativa do RNAm para citocinas e microRNAs (miRNAs) nos pacientes e indivíduos controle (CT). Os indivíduos foram divididos em três grupos S-IgE+ (n = 32), SIgE- (n = 19) e CT (n = 31) por meio dos sintomas clínicos, teste cutâneo de puntura (TCP) e níveis séricos de IgE específica a Dp. Amostras de sangue foram coletadas e o soro utilizado para mensurar IgG1, IgG3, IgG4 e IgA específicas ao extrato alergênico bruto de Dp pelo imunoensaio enzimático (ELISA). Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) dos grupos (S-IgE+, 15; S-IgE-, 11; CT, 10) foram isoladas e estimuladas com mitógeno (fitohemaglutinina PHA), extrato bruto de Dp e somente com meio para controle. O sobrenadante foi coletado depois de 4 dias para avaliar os níveis de citocinas, e as células foram utilizadas para extração de RNA para a avaliação da expressão relativa das citocinas e miRNAs por reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-qPCR). Os níveis de IgE e IgG4 específicos a Dp apresentaram soropositividade significantemente maiores nos pacientes do grupo S-IgE+ comparados aos grupos S-IgE- e CT. A dosagem de IgG3 específica a Dp mostrou níveis significantemente maiores no grupo S-IgE+ somente quando comparada ao grupo CT. Níveis de IgA e IgG1 não apresentaram diferença significante entre os grupos. Se por um lado os níveis de IL-5 no sobrenadante de cultura foram maiores no grupo S-IgE+ e com diferença estatística quando comparados aos outros grupos, por outro lado não foi observada diferença significante nos níveis de IL-4, IL-10, IL-13, IL-17 e IFN-γ entre os grupos, assim como os níveis das citocinas dosadas no soro incluindo a IL-5. A expressão relativa de IL-5, IFN-γ, TGF-β e miRNA em PBMCs estimuladas com alérgenos de Dp mostrou valores significantes, com valores de IL-5 aumentados no grupo S-IgE+ quando comparados aos valores dos grupos S-IgE- e CT; IFN-γ apresentou valor maior e significante no grupo S-IgE+ apenas quando comparado ao grupo CT e TGF-β foi mais expressivo no grupo S-IgE-. A expressão relativa dos miRNAs (miR-21 e miR-126) não mostrou diferença significante. Nossos dados sugerem que houve maior similaridade nos níveis de anticorpos e citocinas no sobrenadante de cultura de células estimuladas com Dp e no soro entre os pacientes S-IgE- e o grupo CT do que com o grupo S-IgE+, apesar dos sintomas nos pacientes S-IgE- serem desencadeados depois da exposição a poeira domiciliar assim como nos pacientes S-IgE+, demonstrando que o mecanismo da resposta por anticorpos e citocinas é diferente entre os grupos S-IgE- e S-IgE+. Além disso, a expressão relativa das citocinas mostrou diferenças o que foi parcialmente visto na dosagem das citocinas, o que pode ser explicado pela diferença que ocorre entre a tradução e transcrição das proteínas. Não foi observada diferença na expressão relativa dos miRNAs, sendo que uma possível causa seria devido ao reduzido número de amostras testadas. Desta forma, nossos dados mostraram que os perfis de anticorpos, citocinas e miRNAs analisados neste estudo não foram capazes de discriminar estes grupos, assim estudos adicionais serão necessários para elucidar o real mecanismo imunopatogênico deste complexo grupo de pacientes do grupo S-IgE-.
Abstract: Allergic rhinitis with symptomatology and IgE (S-IgE+) is a classical disease with a pattern of inflammation of the upper airways well characterized by Th2 pathway regulation. However, the rhinitis with symptomatology triggered by house dust exposure and no systemic IgE (S-IgE-) is involved by an unknown IgE- independent mechanism, which is not well understood yet. The aims of this study were to investigate antibody responses to house dust mite (HDM) Dermatophagoides pteronyssinus (Dp), cytokine levels, relative expression of mRNA cytokines and microRNA (miRNA) in patients and control (CT) subjects. Three groups of subjects divided in S-IgE+ (n = 32), S-IgE- (n = 19), and CT (n = 31) by clinical symptoms, skin prick test (SPT) and levels of specific IgE to Dp were analyzed. Blood samples were collected and sera were used to measure IgG1, IgG3, IgG4, and IgA specific to crude Dp allergen extract by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from subjects (S-IgE+, 15; S-IgE-, 11; CT, 10) were isolated and stimulated with mitogen (phytohemagglutinin-PHA), crude Dp allergens extract, and medium alone for control. Supernatants were collected after 4 days to evaluate the cytokine levels, and cells were harvested for RNA extraction to assess the relative expression of cytokines and miRNA by reverse transcription PCR (RT-qPCR). Specific IgE and IgG4 anti- Dp showed seropositivity rate significantly higher in S-IgE+ than S-IgE- or CT subjects. Specific IgG3 to Dp showed significant higher levels in S-IgE+ than CT group. Levels of Dpspecific IgA and IgG1 showed no significant difference among the groups. The cytokine IL-5 was significantly higher in cell culture supernatants after Dp stimulation from S-IgE+ patients than S-IgE- or CT subjects. However, levels of IL-4, IL-10, IL-13, IL-17 and IFN-γ were not significantly different among groups, as well as the cytokine levels in sera, including IL-5. Relative expression of IL-5, IFN-γ and TGF-β in PBMCs stimulated with Dp allergens showed significant values, with higher levels of IL-5 in S-IgE+ compared to S-IgEand CT groups; IFN-γ showed higher expression in S-IgE+ when compared to CT; and TGF-β presented higher expression in S-IgE- group. miRNAs relative expression was similar among groups. In the overall, our data suggested that S-IgE- patients showed serum antibodies, cytokines in the supernatant of the cell culture stimulated with Dp allergens and in sera more similar to CT individuals than to S-IgE+, although the symptoms in S-IgE- patients were triggered after house dust exposure like S-IgE+ patients, demonstrating that the mechanism of the antibody and cytokine responses are quite different between S-IgE- and SIgE+ groups. In addition, the relative expression of IL-5, IFN-γ and TGF-β was quite different of seen in cytokine levels measure, explained by the difference between the relative expression of gene and its protein. For miRNA in PBMCs stimulated with Dp allergens were not significantly different among the three groups, and a reason could be the small sample tested. Our findings showed that antibody, cytokine and miRNAs profiles analyzed in this study were not able do discriminate these groups, additional studies will be needed for elucidation of the real immunopathogenic mechanisms of this complex S-IgE- group of patients.
Keywords: Anticorpos
Citocinas
Dermatophagoides pteronyssinus
IgE
MicroRNA
Rinite não alérgica
Antibodies
Cytokines
Nonallergic rhinitis
Rinite alérgica
Area (s) of CNPq: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::IMUNOLOGIA::IMUNOLOGIA APLICADA
Language: por
Country: BR
Publisher: Universidade Federal de Uberlândia
Institution Acronym: UFU
Department: Ciências Biológicas
Program: Programa de Pós-graduação em Imunologia e Parasitologia Aplicadas
Quote: MIRANDA, Juliana Silva. Avaliação dos níveis de anticorpos, citocinas e mirnas em pacientes com rinite mediada e não mediada por anticorpos IgE. 2015. 102 f. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas) - Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 2015.
URI: https://repositorio.ufu.br/handle/123456789/16613
Date of defense: 28-Jul-2015
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