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metadata.dc.type: Tese
metadata.dc.rights: Acesso Aberto
Title: Fracionamento, deglicosilação química, caracterização parcial e identificação de antígenos de Strongyloides venezuelensis aplicados no imunodiagnóstico da estrongiloidíase humana
Other Titles: Fractionation, chemical deglycosylation, partial characterization and identification of Strongyloides venezuelensis antigenic fractions in human Strongyloidiasis immunodiagnosis
metadata.dc.creator: Gonzaga, Henrique Tomaz
metadata.dc.contributor.advisor1: Costa-cruz, Julia Maria
metadata.dc.contributor.advisor-co1: Cunha Junior, Jair Pereira da
metadata.dc.contributor.referee1: Costa, Idessania Nazareth da
metadata.dc.contributor.referee2: Sopelete, Mônica Camargo
metadata.dc.contributor.referee3: Gomes, Angelica de Oliveira
metadata.dc.contributor.referee4: Kanamura, Hermínia Yohko
metadata.dc.description.resumo: Strongyloides stercoralis, nematódeo parasito intestinal, infecta milhões de pessoas. A reatividade cruzada é limitante para o imunodiagnóstico e é atribuída a complexidade dos preparados antigênicos e às glicoproteínas. Com o objetivo de aprimorar o imunodiagnóstico da estrongiloidíase humana, este estudo avaliou frações antigênicas heterólogas obtidas de Strongyloides venezuelensis. O extrato salino (ES) de larvas filarioides de S. venezuelensis foi fracionado por cromatografia de troca iônica (resina dietilaminoetil Sepharose DEAE) nas frações DEAE S1 e DEAE S2 que interagiu com a resina ou de gel filtração (resina Sephacryl S-100) nas frações F1, F2, F3 e F4. Larvas íntegras e ES foram tratados com metaperiodato de sódio (MP) para deglicosilação química e verificação de alterações nos carboidratos. O ES e suas frações foram avaliadas em eletroforese unidimensional para caracterização do perfil proteico e testados em amostras de soro [pacientes com estrongiloidíase (G1), com outras infecções parasitárias (G2) e indivíduos saudáveis de área endêmica (G3)] para detecção de IgG e subclasses anti-Strongyloides por ELISA. Sensibilidade (Se), especificidade (Es), area under curve (AUC), likelihood ratio (LR), intermediate range (IR) e valid range proportion (VRP) foram os parâmetros de diagnóstico calculados. A identificação de proteínas de interesse diagnóstico por espectrometria de massa foi realizada após seleção da fração por ELISAIgG. Os epítopos de células B foram preditos. DEAE S1 e DEAE S2 apresentaram perfis proteicos complementares ao do ES, com enriquecimento de polipeptídeos diferencial (DEAE S1 21 a < 15 kDa; DEAE S2 21 a 50 kDa). A fração DEAE S2 obteve elevado valor diagnóstico para a detecção de IgG (Se 92 %, Es 93 %, AUC 0,981, LR+ 10,75, LR− 0,09). Larvas apresentaram marcação modificada para localização de carboidratos e no ES não foram encontrados carboidratos após MP. Os perfis eletroforéticos dos polipeptídeos foram semelhantes entre ES antes e após a adição de MP. Sensibilidade no ELISA atingiu 92,5 %, Es 94,6 %, LR+ 16,9 e LR− 0,08 para MP. Interação significante entre subclasses de IgG e extratos foi demonstrada para pacientes com estrongiloidíase (P = 0,02), com redução nos níveis detectados. A fração F2 teve bandas marcadas nas regiões de 13, 22, 25, 30, 33, 37, 45, 60, 70 e 140 kDa. Os valores de IR e VRP foram melhores para o teste ELISA-F2 (IR 23; VRP 98,9 %). A média do índice ELISA (IE) no G1 foi maior para o ES, quando comparado às frações F1-F4 (P < 0,0001), mas F2 manteve a porcentagem de amostras IgG-positivas (94 %). A redução do IE foi acompanhada da não detecção de IgG em G2. No G3 apenas F2 mostrou redução de IE em relação ao ES (t = 7,020, P < 0,0001). Foram selecionadas e excisadas as bandas de aproximadamente 60 e 33 kDa de regiões polipeptídicas de F2 no gel 1D para análise por espectrometria de massas. Foram consideradas com identificação confiável três proteínas homólogas de Strongyloides ratti: aspartic protease 4 (ASP-4), 14-3-3 zeta e heat shock protein 60 (HSP60). Concluiuse que (1) a fração DEAE S2 demonstrou ser fonte de peptídeos sensíveis e específicos para detecção de IgG no sorodiagnóstico da estrongiloidíase humana, (2) a deglicosilação química do antígeno larval diminuiu a reatividade cruzada/ e os falsos positivos nos grupos controle, demonstrando o papel dos resíduos de carboidratos no reconhecimento da IgG e suas subclasses anti-Strongyloides e (3) F2, obtida após gel filtração, é composta por proteínas imunodominantes que permitirão a definição de epítopos para utilização em ensaios vacinais ou de diagnóstico da estrongiloidíase humana.
Abstract: Strongyloides stercoralis, intestinal nematode parasite, infects millions of people. The cross-reactivity in immunodiagnosis is credited to antigenic complexity and glycoproteins. The aim of this study was to evaluate different heterologous antigenic fractions in human strongyloidiasis immunodiagnosis. Saline extract (SE) of infective larvae of S. venezuelensis was fractionated in ion exchange resin (diethylaminoethyl Sepharose - DEAE; fractions named DEAE S1 and DEAE S2 - which interacted with the resin) or gel filtration chromatography (Sephacryl S-100 resin) in F1, F2, F3 and F4. Larvae and SE were treated with sodium metaperiodate (MP) for chemical deglycosylation and verification of changes in carbohydrate content. SE and its fractions were evaluated in one-dimensional electrophoresis to characterize the proteic profile and were tested in serum samples [strongyloidiasis patients (G1), other parasitic infections (G2) and healthy individuals from an endemic area (G3)] for IgG detection and its subclasses by ELISA. Sensitivity (Se), specificity (Sp), area under curve (AUC), likelihood ratio (LR), intermediate range (IR) and valid range proportion (VRP) were calculated as diagnostic parameters. Protein identification by mass spectrometry was made after ELISA-IgG selection. B cell epitope prediction was performed. DEAE S1 and S2 showed protein profiles complementary to ES, with differential polypeptides (DEAE S1 - 21 to < 15 kDa; DEAE S2 - 21 to 50 kDa). DEAE S2 fraction presented higher diagnostic parameters for IgG detection (Se 92%, Sp 93%, AUC 0.981, LR+ 10.75, LR 0.09). Larvae showed distinct localization of carbohydrates and no carbohydrates were detected in SE after MPtreatment. Electrophoretic profiles of polypeptides were similar between SE before and after MP treatment. ELISA sensitivity reached 90 % for MP, Sp 94.6 %, LR+ 16.9, and LR 0.08. Significant interaction between IgG subclasses and extracts was observed for patients with strongyloidiasis (P = 0.02), i.e. reduction in detected levels. F2 gel filtration fraction showed bands of 13, 22, 25, 30, 33, 37, 45, 60, 70 and 140 kDa regions. IR and VRP values were better for ELISA-F2 (IR 23; VRP 98.9 %). ELISA index (EI) median in G1 was higher for SE when compared to F1-F4 fraction (P < 0.0001), however the F2 retained IgG-positive samples (94%). The EI reduction was accompanied by no detection of IgG positive samples in G2 and only F2 showed EI reduction in G3 compared to ES IE (t = 7.020, P < 0.0001). Bands 60 and approximately 33 kDa polypeptide regions from F2 were selected and excised for mass spectrometry analysis. Three homologous proteins of S. ratti were considered with reliable identification: aspartic protease 4 (ASP-4), 14-3-3 zeta and heat shock protein 60 (HSP60). It was concluded that: (1) DEAE fraction S2 was a sensitive and specific source of peptides for IgG detection in human strongyloidiasis diagnosis, (2) chemical deglycosylation overcome cross-reactivity in the control groups, demonstrating the role of carbohydrate residues in the recognition of anti-Strongyloides IgG and its subclasses and (3) F2 obtained after gel filtration, is composed of immunodominant proteins, which will allow definition of epitopes for vaccine protocols and diagnostic assays in human strongyloidiasis.
Keywords: Antígeno heterólogo
Cromatografia
Espectrometria de massas
Glicoproteínas
Strongyloides stercoralis
Sorodiagnóstico
Heterologous antigens
Glycoproteins
Chromatography
Mass spectrometry
Serodiagnosis
Estrongiloidíase
Antígenos
metadata.dc.subject.cnpq: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::IMUNOLOGIA::IMUNOLOGIA APLICADA
metadata.dc.language: por
metadata.dc.publisher.country: BR
Publisher: Universidade Federal de Uberlândia
metadata.dc.publisher.initials: UFU
metadata.dc.publisher.department: Ciências Biológicas
metadata.dc.publisher.program: Programa de Pós-graduação em Imunologia e Parasitologia Aplicadas
Citation: GONZAGA, Henrique Tomaz. Fractionation, chemical deglycosylation, partial characterization and identification of Strongyloides venezuelensis antigenic fractions in human Strongyloidiasis immunodiagnosis. 2015. 126 f. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas) - Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 2015.
URI: https://repositorio.ufu.br/handle/123456789/16607
Issue Date: 27-Feb-2015
Appears in Collections:TESE - Imunologia e Parasitologia Aplicadas

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