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metadata.dc.type: Dissertação
metadata.dc.rights: Acesso Aberto
Title: Caracterização bioquímica e funcional da rBnSP-7: uma fosfolipase A2 homóloga recombinante de Bothrops pauloensis
metadata.dc.creator: Lima, Lino Fernando Gomes de
metadata.dc.contributor.advisor1: Ávila, Veridiana de Melo Rodrigues
metadata.dc.contributor.advisor-co1: Rodrigues, Renata Santos
metadata.dc.contributor.referee1: Santos, Juliana Izabel dos
metadata.dc.contributor.referee2: Silva, Ludier Kesser Santos
metadata.dc.description.resumo: CAPÍTULO II: As fosfolipases A2 (PLA2s) estão entre os principais componentes de peçonhas animais capazes de promover um largo espectro de efeitos farmacológicos, tais como anticoagulação, inibição da agregação plaquetária, cardiotoxicidade, neurotoxicidade, hipotensão arterial, ação pró-inflamatória e miotoxicidade. As PLA2s também exercem diferentes efeitos tais como ação bactericida, antiparasitária e antitumoral. O presente trabalho teve como objetivo expressar, purificar e caracterizar bioquímica e funcionalmente uma PLA2 Lys-49, denominada BnSP7. O inserto para rBnSP-7 foi obtido previamente a partir de uma biblioteca de cDNA da glândula venenífera de Bothrops pauloensis. Este foi inserido no vetor pPicZA e utilizado para transformação e propagação em E. coli (linhagem DH5) e em seguida inserido no genoma de Pichia pastoris linhagem KM71H. A indução da expressão ocorreu a 200 rpm, 26°C por 144 horas adicionando-se metanol 0.5% (v/v) diariamente à cultura. A caracterização bioquímica (massa molecular, pI e western blotting) da rBnSP-7 purificada em coluna Ni-NTA super flow confirmaram a autenticidade da proteína expressa. Além disso, a estrutura secundária da rBnSP-7 foi analisada por dicroísmo circular (CD) revelando similaridade entre os espectros de CD das proteínas recombinante e nativa. Quando avaliada funcionalmente, a rBnSP-7 foi capaz de induzir miotoxicidade no músculo gastrocnemio de camundongos, no entanto não foi citotóxica sobre linhagens de células C2C12, tEnd e Hela. Analisados em conjunto, nossos resultados demonstraram que a metodologia empregada para a expressão da rBnSP7 foi satisfatória, no entanto experimentos adicionais devem ser realizados a fim de obter uma forma da toxina recombinante que apresente maior similaridade em termos de efeitos biológicos quando esta for comparada à toxina selvagem.
Abstract: CHAPTER II: Phospholipase A2 (PLA2) are among main components of animal venoms able to act on a large spectrum of pharmacological effects, such as anticoagulants, platelet aggregation inhibition, cardiotoxicity, neurotoxicity, hypotension, pro-inflammatory action and myotoxicity. The PLA2s also have different effects such as bactericide, antiparasitary and antitumor. The aim of this work was the expression, purification and biochemical and functional characterization of a Lys-49 PLA2, named BnSP-7. The insert for rBnSP-7 was previously obtained from a cDNA library of the Bothrops pauloensis venom gland. This was inserted into the pPicZA vector and used for transformation and propagation into E. coli (DH5 strain) and then inserted in the genome of Pichia pastoris KM71H. The expression was induced at 200 rpm, 26 °C for 144 hours adding methanol 0.5% (v/v) in the culture on a daily basis. The biochemical characterization (molecular weight, pI and western blotting) of purified rBnSP-7, in Ni-NTA superflow column, confirmed the authenticity of the expressed protein. Furthermore, the secondary structure of rBNSP-7 was analyzed by circular dichroism (CD) showing similarity between the CD spectrum of recombinant and native protein. When evaluated functionally, rBnSP-7 was able to induce myotoxicity in gastrocnemius muscle of mice, however there was no cytotoxic effect on C2C12, HeLa and tEnd cell lines. When analyzed in conjunction, our results demonstrated that the methodology used for the expression of rBnSP7 was satisfactory, however additional experiments should be performed in order to obtain a recombinant toxin form at higher similarity in terms of biological effects when it is compared to wild toxin.
Keywords: Expressão heteróloga
P. pastoris
BnSP-7
Bothrops pauloensis
Heterologous expression
Bothrops pauloensis venom
Bioquímica
Esterases
metadata.dc.subject.cnpq: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::GENETICA
metadata.dc.language: por
metadata.dc.publisher.country: BR
Publisher: Universidade Federal de Uberlândia
metadata.dc.publisher.initials: UFU
metadata.dc.publisher.department: Ciências Biológicas
metadata.dc.publisher.program: Programa de Pós-graduação em Genética e Bioquímica
Citation: LIMA, Lino Fernando Gomes de. Caracterização bioquímica e funcional da rBnSP-7: uma fosfolipase A2 homóloga recombinante de Bothrops pauloensis. 2013. 96 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas) - Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 2013.
URI: https://repositorio.ufu.br/handle/123456789/15893
Issue Date: 29-Jul-2013
Appears in Collections:DISSERTAÇÃO - Genética e Bioquímica

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