Publicação: Precipitação de actomiosina de vertebrados por congelamento de fração solúvel
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CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::GENETICA
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RESUMO GERAL -
Miosinas são proteínas motoras que translocam sobre filamentos de
actina e atualmente constituem uma superfamília com 20 classes. Algumas são
conhecidas apenas a estrutura primária através de seqüência gênica, outras já
estão bem caracterizadas bioquimicamente, como as miosinas I, II e V. São
amplamente distribuídas em todas as células eucarióticas. Apresentam como
características bioquímicas: alta atividade ATPase na presença de EDTA e alta
concentração de potássio (atividade K/EDTA-ATPase) e uma baixa atividade
Mg2+-ATPase, que é estimulada por F-actina. Preparação de actomiosina é
obtida a partir da precipitação de fração solúvel de cérebro tanto em baixa
quanto em alta força iônica e esse processo de precipitação constitui um passo
importante para purificar e caracterizar miosina II e V a partir de fração solúvel
de cérebro. Miosina II é precipitada quando a fração solúvel de cérebro é
dializada contra tampão de baixa força iônica, enquanto que, miosina V é
precipitada seletivamente em relação à miossina II, quando a fração solúvel de
cérebro é tratada com alta força iônica, sendo postulado que essa precipitação
de miosina (II e V) seja resultado de sua interação com actina e vesículas.
Recentemente temos obtido a precipitação de actomiosina a partir do
congelamento de fração solúvel de cérebro ou testículo de rato. Neste trabalho
mostramos a purificação de miosina II de testículo de rato e a obtenção de
actomiosina de cérebro de suino, bovino e pintainho através do congelamento
de fração solúvel de cérebro e testículo.
RESUMO - CAPÍTULO I
Actomiosina de testículo de rato foi obtida através do congelamento de fração
solúvel e miosina II foi isolada a partir dessa actomiosina. Testículos foram
homogeneizados em tampão de extração, centrifugado e o sobrenadante
40.000g x 40 foi congelado a -20oC por 48 horas. O sobrenadante foi
descongelado a 4oC, centrifugado a 45.000g x 45 e o precipitado foi lavado
duas vezes com tampão imidazol (pH 7,0 e 9,0, respectivamente). O precipitado
resultante é enriquecido em três polipeptídeos: p205, p43 e um que migra junto
com a frente do gel. Esses polipeptídeos foram solubilizados em tampão pH 10,8
a 27oC. O p205, isolado em Sephacryl S-400, co-sedimenta com F-actina na
ausência, mas não na presença, de ATP e foi marcado com anti-miosina II.
Embora a preparação de testículo, praticamente, não expressou atividade
K/EDTA-ATPásica, uma preparação similar obtida a partir de músculo
esquelético apresentou alta atividade K/EDTA-ATPásica. Nesse trabalho,
miosina II foi isolada a partir de uma preparação de actomiosina obtida pelo
congelamento de fração solúvel de testículo.
RESUMO - CAPÍTULO II
Actomiosina de cérebro de suino, bovino e pintainho foi obtida através do
congelamento de fração solúvel e miosina II e V foram precipitadas
conjuntamente, sendo que miosina de cérebro de suino foi parcialmente isolada
a partir dessa actomiosina. Os cérebros foram homogeneizados em tampão de
extração, centrifugado e o sobrenadante 40.000g x 40 foi congelado a -20oC por
48 horas. O sobrenadante foi descongelado a 4oC, centrifugado a 45.000g x 45
e o precipitado foi lavado duas vezes com tampão imidazol (pH 7,0 e 10,
respectivamente). O precipitado resultante é enriquecido em três polipeptídeos:
p205, p53, p43 e possui alta atividade Mg2+-ATPase. Esses polipeptídeos foram
solubilizados em tampão pH 10,2 a 27oC, com adição de ATP, Mg e NaCl. O
p205 de cérebro de suino foi parcialmente isolado em Sephacryl S-500. Esse
polipeptídeo de 205 kDa foi marcado com anticorpos anti-miosina II e V. Embora
a preparação de cérebro, praticamente, não expressou atividade K/EDTAATPásica,
apresentou atividade Co2+-ATPase e uma estimulação da atividade
Mg2+-ATPase por Tween 20. Nesse trabalho mostramos a precipitação conjunta
de miosina II e V e o isolamento parcial dessas miosinas de cérebro de suino a
partir de uma preparação de actomiosina obtida pelo congelamento de fração
solúvel de cérebro.
Abstract
ABSTRACT - CHAPTER I
Actomyosin from rat testis was obtained by freezing the soluble fraction and
myosin II was isolated from this actomyosin. Testis was homogenized in a buffer
extract, centrifuged, and the 40,000g x 40 supernatant frozen at -20°C for 48
hours. The supernatant was thawed at 4°C, centrifuged at 45.000g x 45 and the
precipitate washed twice with imidazole buffer (pH 7.0 and 9.0, respectively). The
resulting precipitate was enriched in 3 polypeptides: p205, p43 and one that
migrated together with the front of the gel. These polypeptides were solubilized in
pH 10.8 buffer at 27°C. When isolated in a Sephacryl S-400 column, p205 cosedimented
with F-actin in the absence, but not in the presence, of ATP and was
marked with anti-myosin II. Although the testis preparation expressed low
K/EDTA-ATPase activity, a similar preparation obtained from skeletal muscle
exhibited high K/EDTA-ATPase activity. In this study, myosin II was isolated from
an actomyosin preparation obtained by freezing the soluble fraction of testis.
ABSTRACT - CHAPTER II
Actomyosin from swine, bovine and chicks brain was obtained by freezing the
soluble fraction and myosin II and V was precipitate together, and myosin II from
swine brain was partially isolated from this actomyosin. Brain was homogenized
in a buffer extract, centrifuged, and the 40,000g x 40 supernatant frozen at -20°C
for 48 hours. The supernatant was thawed at 4°C, centrifuged at 45.000g x 45
and the precipitate washed twice with imidazole buffer (pH 7.0 and 10.0,
respectively). The resulting precipitate was enriched in 3 polypeptides: p205,
p53, p43 and own high Mg2+-ATPase activity. These polypeptides were
solubilized in pH 10.2 buffer at 27°C, with addition of ATP, Mg and NaCl. The
p205 from swine brain was partially isolated in a Sephacryl S-500 column. This
polypeptide of 205 kDa was marked with antibody anti-myosin II and V. Although
the brain preparation expressed low K/EDTA-ATPase activity, we observed Co2+-
ATPase activity and a stimulation of the Mg2+-ATPase activity by Tween 20. In
this study, showed a precipitation together of myosin II and V, and partially
isolated this myosin from swine brain from actomyosin preparation obtained by
freezing the soluble fraction of brain.
Palavras-chave
Miosina, Actomiosina, Testículos, Cérebro, Vertebrados, Miosina II, Purificação, Rato, ATPase, Brain, Myosin II, Purification, Testis, Rat, Myosin, Vertebrate, Proteínas
Citação
DIAS, Decivaldo dos Santos. Precipitação de actomiosina de vertebrados por congelamento de fração solúvel. 2006. 60 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas) - Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 2006. DOI https://doi.org/10.14393/ufu.di.2006.06