Publicação: Caracterização parcial de uma Ca2+ -ATPase de larva de
Pachymerus nucleorum (Coleoptera: Chrysomelidae: Bruchinae)
Carregando...
Tipo do documento
Data
Direito de acesso
Área do conhecimento
CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::GENETICA
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Autores
Orientador
Coorientador
Resumo
RESUMO GERAL -
O babaçu (Orbignya sp.) é uma palmeira que ocupa vastas áreas na região
meio-norte do Brasil e desempenha um papel importante na subsistência de
milhares de habitantes desta região. Pachymerus nucleorum é um besouro da
subfamília Bruchinae, cujos representantes são conhecidos como brocas de
sementes, que causa muitos danos nas castanhas do babaçu. As larvas deste
animal penetram o coco de babaçu logo após sua eclosão, se desenvolvem
alimentando-se das castanhas e somente emergem como adultos. Neste trabalho,
estudamos a atividade enzimática de hidrólise de ATP por uma fração protéica
parcialmente purificada a partir das larvas de P. nucleorum sem o aparelho
digestivo. As larvas foram extraídas dos cocos, lavadas e dissecadas para a
retirada do aparelho digestivo. Seguimos o processo de purificação a partir do
restante do corpo e obtivemos a fração precipitada (P3) com alta atividade
ATPásica em presença de cálcio, que foi caracterizada. A dosagem da atividade
ATPásica foi realizada incubando-se amostras das frações em meio de reação
tamponado contendo ATP 1 mM em concentração final e os respectivos cátions
metais em 4 mM. A fração ATPase não apresentou atividade significativa em
2
presença de magnésio, cobalto, cobre, zinco, bário, lítio ou ferro. Mesmo na
ausência de cátions (EDTA ou EGTA 5 mM) a atividade ATPásica é baixa, mas
não nula. Esta alta atividade Ca2+-ATPásica é inibida em presença de cobalto,
cobre, zinco, bário ou ferro 4 mM. Há uma sensível inibição (50%) pela presença
de magnésio 0,25 mM. A atividade ATPásica de P3, em presença de ATP 1 mM,
chega a 50% com CaCl2 0,5 mM, atingindo um platô com 2 mM. Com CaCl2 1
mM, a atividade ATPásica atinge 50% com 0,7 mM de ATP e o pico com 2 mM.
Contudo, observa-se que há um leve decaimento desta atividade com
concentrações de ATP maiores que 2 mM. P3 não utiliza pirofosfato nem
nucleotídeos mono e difosfato para sua atividade, e a atividade Ca2+-GTPásica é
apenas 20% da Ca2+-ATPásica. Esta fração não sofre inibição significativa por
vanadato (em concentrações menores que 200 µM), azida, Triton X-100 ou
fluoreto de alumínio. Tal fração é estável a 4 ºC por pelo menos 12 dias, porém
seu congelamento ( 20 ºC) causa perda de mais da metade da atividade com 24
horas de estocagem. A atividade K+/EDTA-ATPásica é 50% da Ca2+-ATPásica, e
não ocorreu marcação com anticorpos anti-miosinas II ou V. Neste trabalho
obtivemos uma fração enriquecida em atividade Ca2+-ATPásica a partir de larva
de Pachymerus nucleorum sem aparelho digestivo, e caracterizamos
parcialmente tal atividade.
RESUMO - CAPÍTULO I
Uma fração com alta atividade Ca2+-ATPásica foi obtida a partir de larvas
de Pachymerus nucleorum. As larvas foram dissecadas para a retirada do
aparelho digestivo. O restante do corpo foi homogeneizado em tampão de
extração e centrifugado a 15000xg por 30 minutos. A fração precipitada resultante
P1 foi homogeneizada em tampão de ressuspensão contento Triton X-100 0,2%,
incubada por 20 minutos em temperatura ambiente e centrifugada nas mesmas
condições. O precipitado, fração P2, foi então homogeneizado em tampão de
ressuspensão contendo pirofosfato 50 mM. Após incubação por 20 minutos em
temperatura ambiente seguiu-se centrifugação a 40000xg por 30 minutos. A
fração precipitada P3 foi homogeneizado em tampão de ressuspensão e
apresentou alta atividade Ca2+-ATPásica, que foi caracterizada. A fração P3 não
apresentou atividade ATPásica significativa em presença de alguns cátions:
magnésio, cobalto, cobre, zinco, bário, lítio ou ferro. A alta atividade Ca2+-
ATPásica é inibida em presença de cobalto, cobre, zinco, bário ou ferro 4 mM.
Magnésio 0,25 mM causa inibição de 50% desta atividade. Em presença de ATP
1 mM, a atividade ATPásica de P3 chega a 50% com CaCl2 0,5 mM, atingindo um
29
platô com 2 mM. Com CaCl2 1 mM, a atividade ATPásica atinge 50% com 0,7 mM
de ATP e o pico com 2 mM. Contudo, observa-se que há um leve decaimento
desta atividade com concentrações de ATP maiores que 2 mM. P3 não utiliza
pirofosfato nem nucleotídeos mono e difosfato como substratos, e a atividade
Ca2+-GTPásica é apenas 20% da Ca2+-ATPásica. Esta fração não sofre inibição
significativa por vanadato, em concentrações menores que 200 µM, azida, Triton
X-100 ou fluoreto de alumínio. A atividade K+/EDTA-ATPásica é 50% da Ca2+-
ATPásica, e não ocorreu marcação com anticorpos anti-miosinas II ou V. Neste
trabalho obtivemos uma fração enriquecida em atividade Ca2+-ATPásica a partir
de larva de Pachymerus nucleorum sem aparelho digestivo, e caracterizamos
parcialmente tal atividade.
Abstract
A high Ca2+-ATPase activity fraction was obtained from Pachymerus
nucleorum larvae. The larvae were dissected in order to take off the digestive
system. The remaining material was homogeneized in extraction buffer and
centrifuged at 15000xg for 30 minutes. The resulting precipitate, fraction P1, was
homogeneized in imidazole buffer containing Triton X-100 0.2%, incubated for 20
minutes at room temperature and centrifuged under the aforementioned
conditions. The precipitate fraction P2 was homogeneized in imidazole buffer
containing 50 mM pyrophosphate. After incubation for 20 minutes at room
temperature, a centrifugation at 40000xg for 30 minutes was done. The precipitate
fraction P3 was homogeneized in imidazole buffer and presented high Ca2+-
ATPase activity that was characterized. The fraction P3 did not present significant
ATPase activity in presence of some cations: magnesium, cobalt, cupper, zinc,
barium, lithium or iron. The high Ca2+-ATPase activity was inhibited in presence of
4 mM cobalt, cupper, zinc, barium or iron. 0.25 mM magnesium caused 50%
inhibition of this activity. In presence of 1 mM ATP the P3 ATPase activity gets
50% with 0.5 mM CaCl2, reaching a plateau with 2 mM. In presence of 1 mM
31
CaCl2 the ATPase activity gets 50% with 0.7 mM ATP and the pick with 2 mM.
However we observed that there is a slight decline of this activity with ATP
concentrations higher than 2 mM. P3 used neither pyrophosphate nor mono- or
diphosphate nucleotides as substrate, and the Ca2+-GTPase activity is only 20%
that of the Ca2+-ATPase. This fraction did not undergo significant inhibition by
vanadate, in concentrations smaller than 200 µM, azide, Triton X-100 or aluminum
fluoride. The K+/EDTA-ATPase activity was 50% of the Ca2+-ATPase and did not
occur imunoreactivity with anti-myosin II or V antibodies. In this work we obtained
a Ca2+-ATPase activity enriched fraction from Pachymerus nucleorum larvae
lacking digestive system and partially characterized this activity.
Palavras-chave
Bruchinae, Ca2+ -ATPase, Pachymerus nucleorum
Citação
CRUZ, Gabriel Costa Nunes da. Caracterização parcial de uma Ca2+ -ATPase de larva de
Pachymerus nucleorum (Coleoptera: Chrysomelidae: Bruchinae). 2006. 77 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas) - Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 2006.