Caracterização parcial de uma Ca2+ -ATPase de larva de
Pachymerus nucleorum (Coleoptera: Chrysomelidae: Bruchinae)

Cruz, Gabriel Costa Nunes da

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Document type:	Dissertação
Access type:	Acesso Aberto
Title:	Caracterização parcial de uma Ca2+ -ATPase de larva de Pachymerus nucleorum (Coleoptera: Chrysomelidae: Bruchinae)
Author:	Cruz, Gabriel Costa Nunes da
First Advisor:	Coelho, Milton Vieira
First member of the Committee:	Santos, Hérica de Lima
Second member of the Committee:	Ciancaglini, Pietro
Summary:	RESUMO GERAL - O babaçu (Orbignya sp.) é uma palmeira que ocupa vastas áreas na região meio-norte do Brasil e desempenha um papel importante na subsistência de milhares de habitantes desta região. Pachymerus nucleorum é um besouro da subfamília Bruchinae, cujos representantes são conhecidos como brocas de sementes, que causa muitos danos nas castanhas do babaçu. As larvas deste animal penetram o coco de babaçu logo após sua eclosão, se desenvolvem alimentando-se das castanhas e somente emergem como adultos. Neste trabalho, estudamos a atividade enzimática de hidrólise de ATP por uma fração protéica parcialmente purificada a partir das larvas de P. nucleorum sem o aparelho digestivo. As larvas foram extraídas dos cocos, lavadas e dissecadas para a retirada do aparelho digestivo. Seguimos o processo de purificação a partir do restante do corpo e obtivemos a fração precipitada (P3) com alta atividade ATPásica em presença de cálcio, que foi caracterizada. A dosagem da atividade ATPásica foi realizada incubando-se amostras das frações em meio de reação tamponado contendo ATP 1 mM em concentração final e os respectivos cátions metais em 4 mM. A fração ATPase não apresentou atividade significativa em 2 presença de magnésio, cobalto, cobre, zinco, bário, lítio ou ferro. Mesmo na ausência de cátions (EDTA ou EGTA 5 mM) a atividade ATPásica é baixa, mas não nula. Esta alta atividade Ca2+-ATPásica é inibida em presença de cobalto, cobre, zinco, bário ou ferro 4 mM. Há uma sensível inibição (50%) pela presença de magnésio 0,25 mM. A atividade ATPásica de P3, em presença de ATP 1 mM, chega a 50% com CaCl2 0,5 mM, atingindo um platô com 2 mM. Com CaCl2 1 mM, a atividade ATPásica atinge 50% com 0,7 mM de ATP e o pico com 2 mM. Contudo, observa-se que há um leve decaimento desta atividade com concentrações de ATP maiores que 2 mM. P3 não utiliza pirofosfato nem nucleotídeos mono e difosfato para sua atividade, e a atividade Ca2+-GTPásica é apenas 20% da Ca2+-ATPásica. Esta fração não sofre inibição significativa por vanadato (em concentrações menores que 200 µM), azida, Triton X-100 ou fluoreto de alumínio. Tal fração é estável a 4 ºC por pelo menos 12 dias, porém seu congelamento ( 20 ºC) causa perda de mais da metade da atividade com 24 horas de estocagem. A atividade K+/EDTA-ATPásica é 50% da Ca2+-ATPásica, e não ocorreu marcação com anticorpos anti-miosinas II ou V. Neste trabalho obtivemos uma fração enriquecida em atividade Ca2+-ATPásica a partir de larva de Pachymerus nucleorum sem aparelho digestivo, e caracterizamos parcialmente tal atividade. RESUMO - CAPÍTULO I Uma fração com alta atividade Ca2+-ATPásica foi obtida a partir de larvas de Pachymerus nucleorum. As larvas foram dissecadas para a retirada do aparelho digestivo. O restante do corpo foi homogeneizado em tampão de extração e centrifugado a 15000xg por 30 minutos. A fração precipitada resultante P1 foi homogeneizada em tampão de ressuspensão contento Triton X-100 0,2%, incubada por 20 minutos em temperatura ambiente e centrifugada nas mesmas condições. O precipitado, fração P2, foi então homogeneizado em tampão de ressuspensão contendo pirofosfato 50 mM. Após incubação por 20 minutos em temperatura ambiente seguiu-se centrifugação a 40000xg por 30 minutos. A fração precipitada P3 foi homogeneizado em tampão de ressuspensão e apresentou alta atividade Ca2+-ATPásica, que foi caracterizada. A fração P3 não apresentou atividade ATPásica significativa em presença de alguns cátions: magnésio, cobalto, cobre, zinco, bário, lítio ou ferro. A alta atividade Ca2+- ATPásica é inibida em presença de cobalto, cobre, zinco, bário ou ferro 4 mM. Magnésio 0,25 mM causa inibição de 50% desta atividade. Em presença de ATP 1 mM, a atividade ATPásica de P3 chega a 50% com CaCl2 0,5 mM, atingindo um 29 platô com 2 mM. Com CaCl2 1 mM, a atividade ATPásica atinge 50% com 0,7 mM de ATP e o pico com 2 mM. Contudo, observa-se que há um leve decaimento desta atividade com concentrações de ATP maiores que 2 mM. P3 não utiliza pirofosfato nem nucleotídeos mono e difosfato como substratos, e a atividade Ca2+-GTPásica é apenas 20% da Ca2+-ATPásica. Esta fração não sofre inibição significativa por vanadato, em concentrações menores que 200 µM, azida, Triton X-100 ou fluoreto de alumínio. A atividade K+/EDTA-ATPásica é 50% da Ca2+- ATPásica, e não ocorreu marcação com anticorpos anti-miosinas II ou V. Neste trabalho obtivemos uma fração enriquecida em atividade Ca2+-ATPásica a partir de larva de Pachymerus nucleorum sem aparelho digestivo, e caracterizamos parcialmente tal atividade.
Abstract:	A high Ca2+-ATPase activity fraction was obtained from Pachymerus nucleorum larvae. The larvae were dissected in order to take off the digestive system. The remaining material was homogeneized in extraction buffer and centrifuged at 15000xg for 30 minutes. The resulting precipitate, fraction P1, was homogeneized in imidazole buffer containing Triton X-100 0.2%, incubated for 20 minutes at room temperature and centrifuged under the aforementioned conditions. The precipitate fraction P2 was homogeneized in imidazole buffer containing 50 mM pyrophosphate. After incubation for 20 minutes at room temperature, a centrifugation at 40000xg for 30 minutes was done. The precipitate fraction P3 was homogeneized in imidazole buffer and presented high Ca2+- ATPase activity that was characterized. The fraction P3 did not present significant ATPase activity in presence of some cations: magnesium, cobalt, cupper, zinc, barium, lithium or iron. The high Ca2+-ATPase activity was inhibited in presence of 4 mM cobalt, cupper, zinc, barium or iron. 0.25 mM magnesium caused 50% inhibition of this activity. In presence of 1 mM ATP the P3 ATPase activity gets 50% with 0.5 mM CaCl2, reaching a plateau with 2 mM. In presence of 1 mM 31 CaCl2 the ATPase activity gets 50% with 0.7 mM ATP and the pick with 2 mM. However we observed that there is a slight decline of this activity with ATP concentrations higher than 2 mM. P3 used neither pyrophosphate nor mono- or diphosphate nucleotides as substrate, and the Ca2+-GTPase activity is only 20% that of the Ca2+-ATPase. This fraction did not undergo significant inhibition by vanadate, in concentrations smaller than 200 µM, azide, Triton X-100 or aluminum fluoride. The K+/EDTA-ATPase activity was 50% of the Ca2+-ATPase and did not occur imunoreactivity with anti-myosin II or V antibodies. In this work we obtained a Ca2+-ATPase activity enriched fraction from Pachymerus nucleorum larvae lacking digestive system and partially characterized this activity.
Keywords:	Bruchinae Ca2+ -ATPase Pachymerus nucleorum
Area (s) of CNPq:	CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::GENETICA
Language:	por
Country:	BR
Publisher:	Universidade Federal de Uberlândia
Institution Acronym:	UFU
Department:	Ciências Biológicas
Program:	Programa de Pós-graduação em Genética e Bioquímica
Quote:	CRUZ, Gabriel Costa Nunes da. Caracterização parcial de uma Ca2+ -ATPase de larva de Pachymerus nucleorum (Coleoptera: Chrysomelidae: Bruchinae). 2006. 77 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas) - Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 2006.
URI:	https://repositorio.ufu.br/handle/123456789/15851
Date of defense:	28-Feb-2006
Appears in Collections:	DISSERTAÇÃO - Genética e Bioquímica

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