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Document type: Dissertação
Access type: Acesso Aberto
Title: Interação entre IQGAP1 e actina mediado por CDC42 e RAC1
Author: Pereira, Rafael Luzes
First Advisor: Cameron, Luiz Claudio
First member of the Committee: Hamaguchi, Amélia
Second member of the Committee: Bassini, Adriana
Third member of the Committee: Coelho, Milton Vieira
Fourth member of the Committee: Provance Junior, David William
Summary: O citoesqueleto é um componente vital, tendo algumas funções básicas para o funcionamento normal e a manutenção das atividades celulares, como a emissão de pseudópodes, o transporte de vesículas e de outros componentes, a migração, entre outros. Estão envolvidos nesses processos microtúbulos, filamentos de actina, filamentos intermediários e várias proteínas associadas. Dentre essas proteínas, podemos citar as pertencentes à familia IQGAP. Elas são proteínas reguladoras da dinâmica de actina, mediadas por GTP e GDP. Três delas estão presentes em humanos, IQGAP1, IQGAP2 e IQGAP3. Essas proteínas são muito similares entre si e têm seus domínios e sequências primárias muito conservadas. A regulação e interações destas proteínas, com actina e pequenas GTPases também são descritas de maneira muito similar. A interação das proteínas IQGAPs com Cdc42, Rac1 e Rho é muito importante na regulação da dinâmica do filamento de actina, podendo acelerar a polimerização ou deprimir, dependendo da interação especificada. Podemos ver como elas estimulam a polimerização de actina, sozinhas ou na presença de IQGAP1. O processo de purificação de IQGAP1 nativo, de rins bovinos, foi elaborado para melhor observar a dinâmica desta proteína. Embora a ligação entre IQGAP1 e actina tenha se mostrado muito forte e resistente a diversos processos de dissociação, mostrou-se sensível à concentração de NaCl. Dentro deste trabalho nosso principal objetivo foi estudar a influência que a interação entre Rac1 e Cdc42 com IQGAP1 exercem na dinâmica do filamento de actina e, mais especificamente, avaliar a influência, no filamento de actina, das interações entre IQGAP1 e Rac1 e IQGAP1 e Cdc42, comparativamente, alem de desenvolver um método de purificação de IQGAP1 nativo.
Abstract: IQGAP1 stimulates branched actin filament nucleation by activating N-WASP, which in turn activates the Arp2/3 complex. N-WASP can be activated by other factors, including GTP-bound forms of Cdc42 and Rac1, which also bind IQGAP1. We report here the use of purified proteins for in vitro binding and actin polymerization assays, and of fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy of cultured cells to illuminate functional interactions involving IQGAP1, N-WASP, and either Cdc42 or Rac1. In pyrene-actin assembly assays in the presence of N-WASP and the Arp2/3 complex, Cdc42 and IQGAP1 cooperatively stimulated actin filament nucleation, primarily by reducing the lag time before assembly Vmax was reached. Cooperativity reflected dose-dependent stimulation by Cdc42 of IQGAP1 binding to N-WASP. Rac1 and IQGAP1 behaved differently. At low Rac1, the two proteins cooperatively reduced the lag time before assembly Vmax was reached, but at high Rac1 Vmax was faster and reached more quickly for Rac1 alone than for either IQGAP1 alone, or the combination of Rac1 and IQGAP1. This negative cooperativity reflected dose-dependent inhibition by Rac1 of IQGAP1 binding to N-WASP. These results suggest that IQGAP1 interacts by distinct mechanisms with Cdc42 versus Rac1 to regulate actin filament assembly through N-WASP in vivo. To address this possibility, FRET microscopy was used to study interactions of GFP-IQGAP1 with mOrange-Cdc42 versus mOrange-Rac1 in live MDCK cells. Robust FRET was observed for both donor/acceptor pairs at F-actin rich cell-cell margins, but the average intermolecular FRET distances closer for IQGAP1-Cdc42 than for IQGAP1-Rac1. The distinct interactions of IQGAP1 with Cdc42 versus Rac1 observed in vitro were thus recapitulated in live cells.
Keywords: Proteínas
Citoesqueleto
IQGAP1
Actina
Rac1
Cdc42
Area (s) of CNPq: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::GENETICA
Language: por
Country: BR
Publisher: Universidade Federal de Uberlândia
Institution Acronym: UFU
Department: Ciências Biológicas
Program: Programa de Pós-graduação em Genética e Bioquímica
Quote: PEREIRA, Rafael Luzes. Interação entre IQGAP1 e actina mediado por CDC42 e RAC1. 2010. 74 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas) - Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 2010.
URI: https://repositorio.ufu.br/handle/123456789/15823
Date of defense: 19-Jul-2010
Appears in Collections:DISSERTAÇÃO - Genética e Bioquímica

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