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metadata.dc.type: Dissertação
metadata.dc.rights: Acesso Aberto
Title: Produção de uma fração concentrada em alfa-amilase salivar humana (HSA) como alvo para descoberta de novos inibidores e fracionamento do extrato hidroalcóolico da casca de Pouteria sp
metadata.dc.creator: Gouveia, Neire Moura de
metadata.dc.contributor.advisor1: Espindola, Foued Salmen
metadata.dc.contributor.referee1: Coelho, Milton Vieira
metadata.dc.contributor.referee2: Pereira, Paulo Sérgio
metadata.dc.description.resumo: Capítulo II: As alfa-amilases (α-1,4-D-glicano-4-glicanohidrolases, EC 3.2.1.1) são enzimas responsáveis pela digestão de carboidratos e são encontradas na saliva e no suco pancreático. As seqüências primárias das alfa-amilases salivar (HSA) e pancreática (HPA) exibem 99% de similaridade estrutural o que sugere que a HSA pode ser um alvo de estudos experimentais de inibição da digestão de carboidratos uma vez que potenciais inibidores teriam comportamentos similares para HPA e HSA. Desse modo, pelas vantagens da coleta não invasiva da saliva em relação ao suco pancreático obteve-se no presente estudo, uma fração denominada HSA-CTI. Com esta preparação verificou-se o efeito inibitório sobre a atividade enzimática da HSA-CTI a partir de preparações do extrato bruto da casca de Pouteria sp. Amostras de saliva foram congeladas por 48h, centrifugadas e o sobrenadante foi sujeito a cromatografia de troca iônica em coluna de Q-Sepharose equilibrada com 25mM de tampão Tris-HCl, pH 8,0 contendo 5mM de EDTA e 5mM de EGTA. A coluna foi lavada com o mesmo tampão de equilíbrio e eluída com um gradiente de NaCl (0-1M). Realizou-se dosagem protéica, SDS-PAGE, Western blotting e medida da atividade amilásica das frações obtidas. A fração HSA-CTI não interagiu com a coluna, sendo assim preparada por liofilização e armazenada em congelador até o momento dos ensaios de inibição. Preparações aquosa por maceração (EAP-C), aquosa por decocção (EADP-C), hidroalcóolica (EHP-C) e etanólica (EEP-C) do extrato da casca (10mg/mL em DMSO) foram testados pré-incubando por 10 e 30min a 37ºC com a fração HSA-CTI (1:10). Somente o polipeptídeo de 56kDa presente nesta fração exibiu reação cruzada com o anticorpo anti-HSA. O extrato EHP-C mostrou-se mais efetivo em inibir a atividade da HSA-CTI. Estes resultados indicam que a HSA-CTI pode ser obtida por um método rápido de cromatografia podendo ser utilizada em ensaios de inibição a partir de extratos vegetais. O extrato de Pouteria sp. apresentou como potencial candidato para estudos de fracionamento e descoberta de novas substâncias com atividade sobre estas enzimas. Capítulo III: Alguns estudos preliminares sobre extratos de plantas do gênero Pouteria (Sapotaceae) abordam seu potencial em inibir a alfa-amilase humana. Estes estudos de inibição podem implicar na descoberta de novas fontes para reduzir a hiperglicemia pós-prandial, importante no tratamento de diabetes e obesidade. Os componentes ativos de Pouteria são ainda na maioria desconhecidos, por isso, o presente estudo fracionou e investigou as substâncias presentes no extrato hidroalcóolico de Pouteria sp. com potencial inibitório sobre a alfa-amilase salivar in vitro. O extrato foi fracionado em coluna Sephadex-LH 20 equilibrada com metanol lavada com água, seguido por acetona. Todas as frações (POUN) foram testadas quanto ao potencial em inibir a alfa-amilase in vitro. As frações POUN2 e 3 foram injetadas em HPLC semipreparativo coluna Supelcosil LC-18 fase móvel metanol:água e analisadas em HPLC analítico coluna Supelcosil LC-18 fase móvel metanol:ácido acético 0,1%. A fração POUN7 apresentou padrões de inibição semelhantes ao extrato bruto inibindo 40,22% a atividade da amilase, além disso, representa 35% do extrato e é marcada por conter 48,81% de taninos em sua composição. As frações POUN2 e 3 inibiram 15% da atividade da amilase sendo constituídas por taninos. O extrato avaliado é rico em taninos concluindo que este é um potencial candidato a outros estudos devido a estas substâncias estarem envolvidos em diversas funções terapêuticas.
Abstract: CHAPTER II: The alpha-amylases (α-1,4-D-glucan-4-glucanohydrolases, EC 3.2.1.1) are enzymes responsible for the digestion of carbohydrates and are found in saliva and in the pancreatic juice. The primary sequences of the salivary (HSA) and pancreatic (HPA) alpha-amylases show structural similarity of 99%. This standart homology suggests that the HSA can be target of experimental studies of the digestion of carbohydrates inhibition, besides studies showed that potential inhibitors have similar behavior to HPA and HSA. Considering the benefits of noninvasive collection of saliva in relation of pancreatic juice, in this present study obtained a fraction called HSA-CTI. Preparations of the crude extract of the bark of Pouteria sp. was tested about the inhibitory effect of enzymatic activity of the HSA-CTI. Samples of saliva were frozen for 48h, centrifugation and the supernatant was subjected to chromatography in Q-Sepharose column (QS-column) equilibrated in 50mM Tris-HCl buffer at pH 8.0 containing 10mM EDTA and 10mM EGTA. The bound proteins were eluted from QS-column with a gradient concentration of NaCl (0-1M). SDS-PAGE, Western blotting assays and amylase activity measured were performed of the obtained fractions. The HSA-CTI fraction not interacted with the column, and thus prepared by lyophilization and stored in the frozen until realization of the inhibition assays. Aqueous preparations for infusion (EAP-C), deccotion (EAP-C), hydroalcoholic (EHP-C) and ethanolic (EEP-C) of the stem bark extract (10mg/mL in DMSO) have assays by pre-incubation at 10 and 30min at 37ºC with the HAS-CTI (1:10). Only the polypeptide of 56Kda, abundant in the fraction, exhibited cross-reaction with anti-HSA antibody. The assay inhibition showed that stem bark extract has effective in to inhibit the HSA-CTI activity. These results indicate that the HSA-CTI can be obtained by a rapid chromatography method can be used in tests of inhibition from plant extracts. The extract of Pouteria sp. presented as a potential candidate for studies of fractionation and discovery of new substances with activity on these enzymes. CHAPTER III: Preliminary studies about extracts from plants of the kind of Pouteria (Sapotaceae) deal their potential to inhibit human alpha-amylase. These studies may involve the discovery of new sources to reduce post-prandial hyperglycemia, important in the treatment of diabetes and obesity. The active components of Pouteria sp. are still mostly unknown, therefore, the present study fractionated and investigated the substances present in the extract of hydroalcoholic Pouteria sp. with the potential inhibitory on the salivary amylase in vitro. The extract has fractionated in Sephadex LH 20 column equilibrated in methanol and washed with water following by acetone. All the fractions (POUN) was assayed to inhibity the alpha-amylase in vitro. POUN 2 and 3 fractions have injected in semipreparative HPLC (Supecolsyl LC-18 column, mobile phase methanol: water) and analyzed in analytical HPLC (Supecolsyl LC-18 Sp column, mobile phase methanol: acetic acid 0.1%). Assay of inhibition showed that fraction POUN7 exhibited inhibition similar of the crude extract with 40.22% and fractions POUN 2 and 3 exibited inhibition with 15% of the amylase activity. The fraction POUN7 has 48.81% of the constitute it in tannin and represent 35% of the composition of extract. The stem bark crude extract Pouteria sp. have composition it rich in tannin, in addition this extract is potential to others studies, due to this substances have involvement in others therapeutic function.
Keywords: Pouteria sp.
Amilase salivar humana
Inibição amilase
Cromatografia de troca iônica
Taninos
Investigação fitoquímica
Human salivary amylase
Amylase inhibition
Ion exchange chromatography
Tannin
Phytochemistry investigation
Plantas medicinais
Enzimas
metadata.dc.subject.cnpq: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::GENETICA
metadata.dc.language: por
metadata.dc.publisher.country: BR
Publisher: Universidade Federal de Uberlândia
metadata.dc.publisher.initials: UFU
metadata.dc.publisher.department: Ciências Biológicas
metadata.dc.publisher.program: Programa de Pós-graduação em Genética e Bioquímica
Citation: GOUVEIA, Neire Moura de. Produção de uma fração concentrada em alfa-amilase salivar humana (HSA) como alvo para descoberta de novos inibidores e fracionamento do extrato hidroalcóolico da casca de Pouteria sp. 2008. 76 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas) - Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 2008.
URI: https://repositorio.ufu.br/handle/123456789/15801
Issue Date: 28-Feb-2008
Appears in Collections:DISSERTAÇÃO - Genética e Bioquímica

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