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metadata.dc.type: Tese
metadata.dc.rights: Acesso Aberto
Title: Construção de uma biblioteca de anticorpos (scFv) apresentada em fagos para seleção, análise e caracterização de antígenos do carrapato bovino (Boophilus microplus)
metadata.dc.creator: Souza, Guilherme Rocha Lino de
metadata.dc.contributor.advisor1: Goulart Filho, Luiz Ricardo
metadata.dc.contributor.referee1: Maranhao, Andrea Queiroz
metadata.dc.contributor.referee2: Szabó, Matias Pablo Juan
metadata.dc.contributor.referee3: Ortega, José Miguel
metadata.dc.contributor.referee4: Espindola, Foued Salmen
metadata.dc.description.resumo: CAPÍTULO I: A amplificação de fragmentos scFv (fragmentos variáveis de cadeia única) de animais imunizados é um importante método na geração de anticorpos monoclonais. Neste trabalho galinhas foram imunizadas com proteínas totais das fases larval e adulta (teleóginas) do carrapato bovino Boophilus microplus para a geração de uma biblioteca combinatorial de anticorpos anticarrapato. RNA total de baço destes animais foram extraídos e reações de amplificação (PCR) foram feitas utilizando iniciadores específicos das regiões variáveis dos anticorpos com a finalidade de obter toda a variabilidade do repertório imune na construção da biblioteca. Cinco ciclos de seleção (biopanning) foram feitos para captura dos clones scFv reativos às proteínas totais de larvas e teleóginas. A afinidade dos clones às proteínas totais do carrapato bovino foi confirmada por imunoensaio (ELISA) demonstrando um aumento da afinidade dos clones ao ligante ao longo dos cinco ciclos de seleção. O sequenciamento dos clones do quinto ciclo demonstrou uma predominância de clones idênticos tanto para a biblioteca construída utilizando proteínas de larvas, quanto para proteínas de teleóginas. Os anticorpos recombinantes scFv foram utilizados para seleção e caracterização de epítopos miméticos à proteínas do carrapato bovino para utilização como imunógenos no controle deste parasita. CAPÍTULO II: Uma biblioteca de anticorpos scFv recombinantes apresentada em fagos filamentosos foi utilizada para análise e caracterização de alvos protéicos contra o carrapato bovino. Uma proteína com alta similaridade a proteína GP80, similar a vitelina, uma abundante proteína encontrada nos ovos de parasitas adultos e larvas, foi reconhecida pelos anticorpos (Fragmentos scFv) nos testes de western blot e sua seqüência foi determinada por sequenciamento N-terminal. Os mesmos clones foram utilizados para seleção de epitopos, em uma biblioteca de peptídeos constrita de sete resíduos flanqueados por duas cisteínas (C7C) expressos em fagos, para obtenção de peptídeos miméticos às proteínas de carrapato. O resultado obtido foi confirmado com a identificação, pelo Fragmento scFv, de motivos protéicos (GP80 e outras proteínas definidas como promissores imunógenos como receptores de serotonina, antígeno B de membrana e outras), expressos na biblioteca de peptídeos recombinantes C7C. A vitelina e outras proteínas já descritas por alguns autores como sendo promissores antígenos vacinais, aqui neste experimento aparecem melhor caracterizada, com regiões imunogênicas reconhecidas por afinidade ao anticorpo recombinante gerado por phage display. Os resultados demonstram a eficiência da utilização de bibliotecas scFv na seleção de novos alvos protéicos contra o carrapato bovino.
Abstract: CAPÍTULO I: The amplification of fragmentos scFv (single chain fragments variable) of immunized animals is an important method to generation of monoclonal antibodies. In this work chickens had been immunized with proteins of the larval and adult phases of the Boophilus microplus for the generation of an antibodies combinatorial library. Total RNA of spleen had been extracted and amplification reactions (PCR) had been made using specific primers of the antibodies variable regions with the purpose to get all the variability of the immune repertoire in the construction of the library. Five cycles of selection (biopanning) had been made for capture of clones scFv reactive to total proteins of larvae and adults ticks. The affinity of clones to proteins was confirmed by ELISA demonstrating an increase of the affinity of clones to the ligante throughout the five cycles of selection. The sequencing of clones demonstrated a predominance of identical clones for the library using both larvae and adults proteins. The recombinant antibodies had been used for selection and characterization of epitope to proteins of the catle tick for use as vaccine in the control of this parasite. CAPÍTULO II: With the objective of selecting and characterizing new ticks vaccine targets, we developed a combinatorial antibody fragment library (scFv), expressed in the capsid of bacteriophages, produced from tick larval and adult protein immunized chicken Ig repertoire These antibodies (scFv) recognize a protein of the total larval and adult s extract of the proximally 80 Kd, by western blotting tests, and the sequence of these reactive proteins was checked by N-terminal sequencing. The band corresponded to a GP80 protein with high similarity and is found in huge quantities in parasite eggs and larval stages. With the objective of selecting mimotopes of B. microplus by phage displayed epitope characterization, the recombinant antibodies with major frequency were submitted to a selection against a constricted peptide library displayed on phages. The cross reactivity was confirmed by the recognition of one of those recombinant antibodes (scFv) to a motif similar to GP80 sequence and others peptide (Serotonin receptor, Notch-like protein, Paramiosin and Antigen B membrane) obtained from peptide library selection. This work confirms the GP80 as a vaccine candidate and points out the usefulness of phage display methodology for selection of new represents the selection efficiency of new B. microplus.vaccine targets.
Keywords: Boophilus microplus
Anticorpo
Fragmento scFv
Biblioteca de anticorpos
Biblioteca de peptídeos
Antibodies
ScFv fragments
Phage display
Antibodies library
Peptide library
Genética molecular
metadata.dc.subject.cnpq: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::GENETICA
metadata.dc.language: por
metadata.dc.publisher.country: BR
Publisher: Universidade Federal de Uberlândia
metadata.dc.publisher.initials: UFU
metadata.dc.publisher.department: Ciências Biológicas
metadata.dc.publisher.program: Programa de Pós-graduação em Genética e Bioquímica
Citation: SOUZA, Guilherme Rocha Lino de. Construção de uma biblioteca de anticorpos (scFv) apresentada em fagos para seleção, análise e caracterização de antígenos do carrapato bovino (Boophilus microplus). 2007. 97 f. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas) - Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 2007.
URI: https://repositorio.ufu.br/handle/123456789/15774
Issue Date: 30-Apr-2007
Appears in Collections:TESE - Genética e Bioquímica

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