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metadata.dc.type: Tese
metadata.dc.rights: Acesso Aberto
Title: Papilomavírus humano: novas abordagens epidemiológicas, diagnósticas e perspectivas vacinais
metadata.dc.creator: Matias, Bruna França
metadata.dc.contributor.advisor1: Goulart Filho, Luiz Ricardo
metadata.dc.contributor.advisor-co1: Marangoni, Karina
metadata.dc.contributor.referee1: Faria, Ana Maria Caetano de
metadata.dc.contributor.referee2: Jardim, Ana Carolina Gomes
metadata.dc.contributor.referee3: Nascimento, Rafael
metadata.dc.contributor.referee4: Teixeira, David Nascimento Silva
metadata.dc.contributor.referee5: Cunha Junior, Jair Pereira da
metadata.dc.description.resumo: Introdução: A infecção por HPV é a doença sexualmente transmissível mais comum em humanos, que pode causar doenças benignas (lesões verrucosas) ou malignas como o câncer anogenital, câncer oral e, com maior incidência, o câncer do colo uterino. Globalmente, o principal método de detecção do HPV baseia-se na avaliação citopatológica de Papanicolaou, entretanto, resultados falsonegativos e obtenção de amostras insatisfatórias dificultam o diagnóstico e a prevenção da doença. Neste contexto, a busca por novas plataformas diagnósticas e profiláticas para o HPV é de grande interesse. Objetivos: O objetivo do presente estudo foi realizar um levantamento epidemiológico da infecção por HPV na populacão feminina da região Sudeste do Brasil e, a partir de então, propor novas abordagens diagnósticas e vacinais. Metodologia: Amostras genitais de 5.223 mulheres foram avaliadas por uma nova ferramenta molecular baseada em PCR (Nested Multiplex PCR - NMPCR), utilizando-se um coquetel de primers para detecção simultânea de 38 diferentes tipos virais de HPV, em um único tubo. Outra abordagem molecular foi proposta através da técnica de Phage Display, a fim de selecionar peptídeos ligantes a anticorpos IgA oriundos de amostras cervicas de pacientes com infecção por HPV. Análises in silico (Bioinformática linear e 3D) e in vitro (ELISA, Slot blot e Bioeletrodo) foram realizadas para a validação dos fagos selecionados e dos peptídeos sintetizados em espécimes cervicais (n=91) e salivares (n=66). Os parâmetros de sensibilidade e especificidade do diagnóstico do HPV foram determinados pela curva ROC. Para testar o potencial vacinal dos peptídeos sintéticos, análises in silico (Bioinformática 3D), in vivo (imunização em camundongos fêmeas BALB/c) e in vitro (MTT, ELISA, Cultura de esplenócitos, CBA e Ensaio de Neutralização) foram conduzidas. Resultados: Dentre as 5.223 mulheres avaliadas, houve uma prevalência de 58,9% de infecção por HPV, com predominância dos tipos 53, 52 e 06, evidenciando a relevância de se propor novas alternativas de detecção e profilaxia do HPV. Na abordagem molecular de Phage Display trinta e dois clones de fagos distintos foram selecionados contra a IgA de amostras cervicais positivas para o HPV. O fago C.B1 apresentou maior reatividade contra amostras de HPV em comparação ao grupo controle negativo, por ELISA. Este peptídeo é um epítopo putativo da proteína principal do capsídeo do HPV (L1) e tem discriminado eficientemente amostras HPV de controles, em amostras cervicais e salivares (p<0,0001); com alta sensibilidade (acima de 95%) e especificidade (acima de 71%) em ambos fluidos. O peptídeo C.B1 também foi incorporado com sucesso (p<0,05) em um bioeletrodo de grafite para o diagnóstico do HPV direto na saliva. Na abordagem vacinal, três peptídeos (PEP1, PEP3 e PEP4) não apresentaram toxicidade em macrófagos murinos. As imunizações revelaram potente indução na produção de anticorpos séricos IgG pelo PEP3, e aumento nos títulos de IgA na mucosa vaginal sob estímulo dos PEP1 e PEP3. A avaliação da resposta imune celular indicou que o PEP1 e, sobretudo o peptídeo quimérico PEP3, foram capazes de polarizar a resposta imune para o perfil Th1 e sensibilizar as células a um status pró-inflamatório, propício para atuação antiviral. O ensaio de neutralização de PsVs do HPV-16 mostrou que o PEP3 foi capaz de reduzir a infecção em 49%. Conclusões: De maneira geral, os estudos aqui apresentados evidenciaram uma alta prevalência de HPV em mulheres brasileiras por tipos virais ainda pouco explorados na literatura mundial. Nós selecionamos mimotopos pela ferramenta de Phage Display capazes de detectar o HPV tanto em amostras de saliva quanto em secreção cervical, possibilitando um diagnóstico simples, de baixo custo, e não invasivo para rastreios populacionais. Além disso, os mimotopos aqui selecionados possuem atraente aplicabilidade em formulações vacinais, porém estudos adicionais ainda são necessários.
Abstract: Introduction: HPV infection is the most common sexually transmitted disease in humans, which can cause benign diseases (warty lesion) or malignant as the anogenital cancer, oral cancer and, with the highest incidence, cervical cancer. Overall, the main HPV detection method is based on cytological evaluation of Papanicolaou; however, false-negative results and unsatisfactory sampling complicate the disease diagnosis and prevention. In this context, the investigation of new diagnosis platforms and prophylaxys has great interest. Objectives: The aim of this study was to conduct an epidemiological study of HPV infection in the women population of southeastern Brazil and then propose new diagnostic and vaccine approaches. Methodology: Genital samples of 5,223 women were evaluated by a new molecular tool based on PCR (Nested Multiplex PCR - NMPCR), using a cocktail of primers for simultaneous detection of 38 different HPV types, in single tube. Another molecular approach was proposed by Phage Display technique to select the IgA binding peptides from cervical samples of patients with HPV infection. In silico (Linear and 3D bioinformatics) and in vitro (ELISA, Slot blot and Bioelectrode) analysis were performed to validate the selected phages and synthetic peptides in cervical (n=91) and salivary specimens (n=66). The sensitivity and specificity parameters of HPV diagnosis were determined by ROC curve. To test the vaccine potential of synthetic peptides, in silico (3D bioinformatic), in vivo (female BALB/c mice immunization) or in vitro analyzes (MTT, ELISA, splenocytes culture, CBA and Neutralization assay) were carried out. Results: Among the 5,223 women evaluated, there was a prevalence of 58.9% of HPV infection, especially the types 53, 52 and 06, showing the relevance to propose new alternatives for HPV detection and prevention. In molecular approach of Phage Display, thirty-two distinct phage clones were selected against IgA from positive HPV cervical samples. Phage C.B1 showed higher reactivity against HPV samples compared to the negative control group by ELISA. This peptide is a putative epitope of HPV major capsid protein (L1) and has distinguished efficiently infection from HPV controls in cervical and saliva samples (p <0.0001), with high sensitivity (above 95%) and specificity (above 71%) in both fluids. The C.B1 peptide was also successfully incorporated (p<0.05) onto a graphite bioelectrode for HPV direct diagnosis in saliva. In the vaccine approach, three peptides (PEP1, PEP3 and PEP4) showed no toxicity in murine macrophages. Immunizations showed potent induction of serum IgG antibodies production by PEP3, and increase in IgA titer in the vaginal mucosa under PEP1 and PEP3 stimuli. The evaluation of cellular immune response indicated that the PEP1 and, particularly, the PEP3 chimeric peptide were able to polarize the immune response towards to Th1 profile and sensitize the cells to a pro-inflammatory \"status\", suitable for antiviral activity. The HPV-16 PsVs neutralization assay showed that PEP3 was able to reduce the infection by 49%. Conclusions: Overall, the studies presented here showed a high prevalence of HPV among Brazilian women by viral types still little explored in the literature. We selected mimotopes by Phage Display tool capable of detecting HPV in both saliva samples as in the cervical secretion, providing a low cost, simple and non-invasive diagnostics for population screening. In addition, the mimotopes selected have attractive applicability in vaccine formulations, but further studies are still needed.
Keywords: HPV
NMPCR
Phage display
IgA
Proteína L1
L1 protein
Vírus do papiloma
Doenças sexualmente transmissiveis
metadata.dc.subject.cnpq: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::GENETICA
metadata.dc.language: por
metadata.dc.publisher.country: BR
Publisher: Universidade Federal de Uberlândia
metadata.dc.publisher.initials: UFU
metadata.dc.publisher.department: Ciências Biológicas
metadata.dc.publisher.program: Programa de Pós-graduação em Genética e Bioquímica
Citation: MATIAS, Bruna França. Papilomavírus humano: novas abordagens epidemiológicas, diagnósticas e perspectivas vacinais. 2015. 160 f. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas) - Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 2015.
URI: https://repositorio.ufu.br/handle/123456789/15762
Issue Date: 3-Sep-2015
Appears in Collections:TESE - Genética e Bioquímica

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