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Document type: Tese
Access type: Acesso Aberto
Title: Desenvolvimento e caracterização de aptâmeros ligantes específicos ao gene PCA3 e implicações na modulação da expressão gênica de células tumorais transfectadas
Author: Marangoni, Karina
First Advisor: Goulart Filho, Luiz Ricardo
First coorientator: Neves, Adriana Freitas
First member of the Committee: Madurro, Ana Graci Brito
Second member of the Committee: Madurro, João Marcos
Third member of the Committee: Faria, Paulo Rogério de
Fourth member of the Committee: Rocha, Rafael Malagoli
Summary: CAPÍTULO II: A expressão do gene PCA3 (prostate cancer antigen 3) tem sido usada como biomarcador prostático tumoral em amostras clínicas de tecido e urina, mais sua função é desconhecida. Análises da sequência do PCA3 predisseram uma configuração terciária significante, baseada na complexa estrutura de dobras da fita dupla, formada por complementaridade de bases de sequências altamente repetitivas. Aptâmeros de RNA foram selecionados contra parte da estrutura do transcrito PCA3, abrangendo os exons 1, 3 e 4. Seis aptâmeros ligantes ao PCA3 com alta afinidade foram selecionados e apenas um, de vários motivos repetitivos dos aptâmeros foi reduzido e sintetizado para validação. O novo aptâmero de RNA biotinilado (CG3) foi usado para detectar o transcrito em cortes histopatológicos de próstata em tissue microarray (TMA) por meio de análises de imunohistoquímica. O aptâmero CG3 biotinilado marcou o citoplasma e núcleo de tecidos de câncer de próstata (CaP) e hiperplasia prostática benigna (HPB) e as células estromais não foram marcadas, corroborando com achados prévios de localização celular do RNA do PCA3. Ensaios imunológicos adicionais forneceram evidências finais de que o aptâmero CG3 tem ligação específica ao transcrito PCA3, e pode ser usado como um biomarcador auxiliar no diagnóstico do CaP. A detecção em sangue periférico e sua interferência na função do transcrito ainda precisa ser demonstrada. CAPÍTULO III: Atualmente, o RNA não codificante PCA3 (prostate cancer antigen 3) é um dos transcritos mais específicos e altamente expresso no câncer de próstata (CaP), e considerado um biomarcador potencial com função desconhecida. Ele faz estruturas de looping que podem ser necessárias, quer para a edição ou processamento. Nossa hipótese é de que a ruptura da estrucuture secundária por um aptâmero de RNA ligante, provavelmente module a expressão de genes que podem ser associados com PCA3 e, consequentemente, com o desenvolvimento do CaP. Um aptâmero de RNA com alta afinidade para o PCA3 (CG3) foi transfectado em linhagens celulares LNCaP e PC3. Um ensaio de ligação inversa e imunohistoquímica com tissue microarrays (TMA) confirmou a sua especificidade para o transcrito PCA3 e para células tumorais, respectivamente. Perfis de expressão gênica diferencial de ambas as células transfectadas sugere uma modulação multigênica pelo PCA3. Pacientes com CaP e hiperplasia prostática benigna (HPB) foram ainda avaliados quanto à expressão do PCA3 em tecido prostático, e além de confirmar o seu potencial de diagnóstico (AUC = 0,80) revelou um padrão semelhante ao das células LNCaP. Finalmente, o comportamento oposto de linhas celulares de CaP indica que o PCA3, AR e os genes de vias de sinalização TLR estão ligados e sua combinação pode ser responsável pelo desenvolvimento do tumor e da transição do perfil hormonal para o perfil de resposta refractária.
Abstract: CHAPTER II:The prostate cancer antigen 3 (PCA3) mRNA expression has been used as a prostate cancer (PCa) biomarker in tissue and urine clinical samples, but its function is unknown. Analysis of the PCA3 sequence has predicted a significant tertiary configuration based on a complex double-stranded fold-back structure formed through the complementary base pairing of highly repetitive sequences. RNA aptamers were selected against the partial structure of the PCA3 transcript encompassing exons 1, 3 and 4. Six PCA3-ligand aptamers with high affinity were selected and one of the most repetitive aptamer motifs was reduced and synthesized for validation. The novel biotinylated RNA aptamer (CG3) was used to detect the transcript on prostate histopathological sections in tissue microarrays (TMA) through immunohistochemical analysis. Biotin-labeled CG3 aptamer stained the cytoplasm and nucleus of PCa and BPH tissue and is absent in stromal cells, corroborating previous findings of the PCA3 RNA cellular localization. Additional immunoassays provided final evidences that the CG3 aptamer has specific binding to the PCA3 transcript, and may be used as an auxiliary biomarker in PCa diagnosis. Its detection in the peripheral blood and interference in the transcript function still remain to be demonstrated. CHAPTER III: Currently, the non-coding prostate cancer antigen 3 (PCA3) is one of the most specific and overexperessed prostate cancer (PCa) genes, and considered a potential biomarker with unknown function. It forms hairpin-loop structures that may be required either for editing or processing. We hypothesized that disruption of its secundary strucuture by an RNA aptamer ligand probably modulates the expression of genes that may be associated with PCA3 and consequently with PCa development. An RNA aptamer with high affinity to PCA3 (CG3) was transfected into LNCaP and PC3 cell lines. A reverse binding assay and immunhistochemistry with tissue microarrays confirmed its specificity to the PCA3 transcript and to PCa cells, respectively. Differential gene expression profiles of both transfected cells suggest a multigenic modulation by the PCA3. PCa and benign prostatic hyperplasia patients were further evaluated for the PCA3 expression in the prostatic tissue, and besides confirming its diagnostic potential (AUC=0.80), it showed a similar pattern to the LNCaP cell. Finally, the opposite behavior of prostate cancer cell lines indicates that PCA3, AR and TLR signaling pathways genes are connected and their combination may be responsible for the tumor development and the transition from the hormonal to the refractory response profile.
Keywords: Próstata Câncer
Câncer de próstata
SELEX
Genômico
Aptâmero de RNA
Biomarcador
Aptâmero CG3
Expressão gênica
LNCaP
PC3
Prostate cancer
PCA3 (prostate cancer antigen 3)
Genomic
RNA aptamer
Biomarker
CG3 aptamer
Gene expression
Area (s) of CNPq: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::GENETICA
Language: por
Country: BR
Publisher: Universidade Federal de Uberlândia
Institution Acronym: UFU
Department: Ciências Biológicas
Program: Programa de Pós-graduação em Genética e Bioquímica
Quote: MARANGONI, Karina. Desenvolvimento e caracterização de aptâmeros ligantes específicos ao gene PCA3 e implicações na modulação da expressão gênica de células tumorais transfectadas. 2011. 133 f. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas) - Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 2011.
URI: https://repositorio.ufu.br/handle/123456789/15739
Date of defense: 8-Jul-2011
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