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metadata.dc.type: Tese
metadata.dc.rights: Acesso Aberto
Title: Caracterização estrutural e funcional de metaloproteases isoladas de peçonhas botrópicas
metadata.dc.creator: Gomes, Mário Sérgio Rocha
metadata.dc.contributor.advisor1: Ávila, Veridiana de Melo Rodrigues
metadata.dc.contributor.referee1: Rodrigues, Renata Santos
metadata.dc.contributor.referee2: Oliveira, Fábio de
metadata.dc.contributor.referee3: Clissa, Patrícia Bianca
metadata.dc.contributor.referee4: Santos, Juliana Izabel dos
metadata.dc.description.resumo: CAPÍTULO II: No presente trabalho demonstramos a caracterização bioquímica e funcional da Botropoidina, uma metaloprotease hemorrágica isolada da peçonha da serpente Bothrops pauloensis. Esta proteína foi purificada após três passos cromatográficos: CM-Sepharose fast flow, HiTrep Sephacryl S-300 RP, HiTrep Capto Q. Botropoidina mostrou-se homogênea em SDS-PAGE sob condições redutoras e não redutoras e apresentou uma única cadeia polipeptídica de 49.558 Da por análises de MALDI-TOF. A proteína apresentou ponto isoelétrico de 3,76 e a sequência de dois fragmentos obtidos por Peptide Mass Fingerprinting (PMF) em MS (MALDI-TOF\\TOF) apresentou score significativo quando comparado com outras SVMPs. Esta enzima apresentou atividade proteolítica sobre azocaseína, as cadeias Aα e Bβ do fibrinogênio, fibrina, colágeno e fibronectina. A enzima foi estável na faixa de pH de 6-9 e em baixas temperaturas quando ensaiada sobre a azocaseína. Além disso, sua atividade foi inibida por EDTA, 1,10-fenantrolina e β-mercaptoetanol. Esta enzima agiu sobre a coagulação sanguínea alterando os tempos de tromboplastina parcial ativada (TTPa) e de protrombina (TP), além de tornar o sangue de camundongos incoagulável. Botropoidina foi capaz de induzir hemorragia (DMH= 0,98μg) e necrose no músculo gastrocnêmio de camundongos, demonstrando uma alta toxicidade. Esta enzima também foi capaz de inibir a agregação plaquetária induzida por colagéno e ADP e interferiu na adesão e viabilidade de células endoteliais tEnd. Considerados em conjunto, estes resultados nos levam a sugerir que Botropoidina é uma α-fibrinogenase hemorrágica capaz de contribur significativamente para a toxicidade do envenenamento por Bothrops pauloensis. CAPÍTULO III: Neste trabalho, uma metaloprotease não hemorrágica e fibrin(ogen)olitica (BleucMP) foi purificada da peçonha da serpente de Bothrops leucurus em dois passos cromatográficos: DEAE-Sephadex A-25 e CM-Sepharose Fast Flow. BleucMP representa 1,75% (m/m) da peçonha bruta e mostrou-se hemogenea em SDS-PAGE. A análise de BleucMP por MALDI TOF/TOF, reveleu uma massa molecular de 23057,54Da e quando alquilada e reduzida sua massa é de 23830.40Da. A análise dos peptídeos gerados por MS (MALDI TOF/TOF) que mostraram score significantes foi comparado com outras proteínas usando NCBIBLAST2 alignment display. Em relação à atividade proteolítica, BleucMP foi eficiente sobre fibrinogênio, fibrina e azocaseína, e foi inibida por EDTA e 1,10- fenantrolina. Esta enzima também foi capaz de diminuir significativamente os níveis de fibrinogênio plasmático, tornando assim o sangue incoagulável. No entanto foi desprovida de atividade hemorrágica quando testada na pele de camundongos e não induziu relevantes alterações bioquímicas, hematológicas e histopatológicas em camundongos. Os aspectos abordados neste trabalho fornecem dados sobre o efeito da BleucMP no envenenamento de serpentes do gênero Bothrops leucurus, a fim de melhor compreender a ação das metaloproteases no envenenamento causado por serpentes.
Abstract: CHAPTER II:In the present work, we demonstrate the biochemical and functional characterization of Bothropoidin, a hemorrhagic snake venom metalloproteinase isolated from Bothrops pauloensis snake venom. This protein was purified after three chromatographic steps on CM-Sepharose fast flow, HiTrep Sephacryl S-300 RP and HiTrep Capto Q. Bothropoidin was homogeneous by SDS-PAGE under reducing and nonreducing conditions, and was shown to present a single chain of 49,558 Da by MALDI TOF analysis. The protein presented isoeletric point of 3.76 and the sequence of two fragments obtained by Peptide Mass Fingerprinting (PMF) in MS (MALDI TOF\\TOF) showed significant score when compared with another SVMPs.This enzyme showed proteolytic activity upon azocasein, Aα- chain of fibrinogen, fibrin, collagen and fibronectin. The enzyme was stable at pH between 6-9 and lower temperatures when assayed on azocasein. Moreover, this activity was inhibited by EDTA, 1,10-phenanthroline and β-mercaptoethanol. This enzyme acted on blood clotting altering the aPTT and PT. Bothropoidin was able to induce hemorrhage (MHD=0.98 μg) and necrosis in the gastrocnenius muscles of mice, showing high toxicity. The protein was capable of inhibiting platelet aggregation induced by collagen and ADP and interfered with viability and cell adhesion when incubated with tEnd endothelial cells in a dose dependent manner. Taken together, these results lead us to suggest that Bothropoidin is a hemorrhagic α-fibrinogenase which can contribute significantly to the toxicity of Bothrops pauloensis envenomation. CHAPTER III: A fibrino(geno)lytic nonhemorrhagic metalloproteinase (BleucMP) was purified from Bothrops leucurus snake venom by two chromatographic steps procedure on DEAE-Sephadex A-25 followed by CM-Sepharose Fast Flow column. BleucMP represented 1.75% (w/w) of the crude venom and was homogeneous on SDS-PAGE. BleucMP analyzed by MALDI TOF/TOF, showed a molecular mass of 23,057.54 Da and when alkylated and reduced, the mass is 23,830.40 Da. Their peptides analyzed in MS (MALDI TOF\\TOF) showed significant score when compared with those of other proteins by NCBI-BLAST2 alignment display. As regards their proteolytic activities, BleucMP efficiently acted on fibrinogen, fibrin, and was inhibited by EDTA and 1.10-phenanthroline. This enzyme was also able to decrease significantly the plasma fibrinogen level provoking blood incoagulability, however was devoid of hemorrhagic activity when tested in the mice skin and did not induce relevant biochemical, hematological and histopathological alterations in mice. The aspects addressed in this paper provide data on the effect of BleucMP in envenomation from B. leucurus snakes in order to better understand the effects caused by snake venom metalloproteinase.
Keywords: Bothrops pauloensis
Metaloprotease hemorrágica
MS(espectrometria de massa)
Células tEnd
Agregação plaquetaria
Bothrops leucurus
Veneno de serpente
Metaloprotease
Fibrin(ogen)olitica
Hemorrhagic metalloproteinase
MS(mass spectrometry)
Platelet aggregation
TEnd cells
Snake venom
Metalloproteinase
Fibrin(ogen)olytic.
Bioquímica
Serpente peçonhenta - Peçonha
Bothrops
metadata.dc.subject.cnpq: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::GENETICA
metadata.dc.language: por
metadata.dc.publisher.country: BR
Publisher: Universidade Federal de Uberlândia
metadata.dc.publisher.initials: UFU
metadata.dc.publisher.department: Ciências Biológicas
metadata.dc.publisher.program: Programa de Pós-graduação em Genética e Bioquímica
Citation: GOMES, Mário Sérgio Rocha. Caracterização estrutural e funcional de metaloproteases isoladas de peçonhas botrópicas. 2013. 141 f. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas) - Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 2013.
URI: https://repositorio.ufu.br/handle/123456789/15738
Issue Date: 22-Mar-2013
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