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metadata.dc.type: Tese
metadata.dc.rights: Acesso Aberto
Title: Esterases e resistência a acaricidas no carrapato bovino Boophilus microplus (Acari, Ixodidae)
metadata.dc.creator: Baffi, Milla Alves
metadata.dc.contributor.advisor1: Bonetti, Ana Maria
metadata.dc.contributor.referee1: Nepomuceno, Júlio César
metadata.dc.contributor.referee2: Goulart Filho, Luiz Ricardo
metadata.dc.contributor.referee3: Bitondi, Marcia Maria Gentile
metadata.dc.contributor.referee4: Ceron, Carlos Roberto
metadata.dc.description.resumo: O carrapato bovino Boophilus microplus é um dos ectoparasitos mais importantes para a agropecuária brasileira, sendo responsável, segundo o Ministério da Agricultura, por prejuízos diretos e indiretos à bovinocultura de, aproximadamente, dois bilhões de dólares ao ano. O método tradicional de controle baseia-se no uso de acaricidas piretróides e organofosforados, cujo uso sistemático tem promovido a seleção de genótipos resistentes em populações de carrapatos. Mutações de ponto em genes codificadores de esterases e o aumento na produção dessas enzimas representam importantes estratégias de resistência, conferindo insensibilidade ao efeito neurotóxico desses compostos orgânicos nessa espécie. Neste trabalho, realizou-se a análise do padrão de esterases nas diferentes fases do ciclo de vida do carrapato, por eletroforese em gel de poliacrilamida nativo e coloração específica para esterases. Os resultados mostraram nove regiões com atividade esterásica, consideradas como produtos de nove alelos distribuídos em sete loci genéticos. Esterases detectadas em todas as fases do desenvolvimento foram consideradas como produtos de genes housekeeping. Esterases estágioespecíficas e sexo-específicas foram, também, detectadas. Linhagens com diferentes níveis de resistência foram selecionadas após o teste de resistência com o organofosforado malation e o piretróide deltametrina em teleóginas provenientes de uma fazenda da região de Uberlândia, MG, com histórico de resistência. A análise do padrão de esterases por eletroforese em gel de poliacrilamida não desnaturante das linhagens sensível (SM), tolerante (TM) e resistente (RM) ao malation e das linhagens sensível (SD), tolerante (TD) e resistente (RD) a deltametrina revelou a presença de quatro regiões com atividade esterásica (EST-1 a EST-4). As enzimas EST-3 e EST-4, classificadas como carboxilesterases (CaEs), foram observadas em todas as linhagens. A EST- 2, classificada como acetilcolinesterase (AChE), foi detectada em todas as linhagens, porém, apresentou intensidade crescente de atividade esterásica, indicando aumento na produção da enzima de acordo com o nível de resistência, provavelmente resultante de amplificação gênica ou alterações pós-traducionais. A EST-1, classificada como AChE, foi detectada exclusivamente nas linhagens tolerantes e resistentes a ambos acaricidas, com maior atividade nas linhagens xvi resistentes (RD e RM). Os resultados indicam que as AChEs detectadas representam importante estratégia de detoxificação aos acaricidas. Essas linhagens foram, também, analisadas pelas técnicas Low Ionic Strength Single Stranded Conformation Polymorphism (LIS-SSCP) e Polimerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP) para investigação de mutações em uma provável CaE. A digestão do fragmento amplificado de 372pb com enzima de restrição Eco RI por PCR-RFLP mostrou três padrões de bandas associados a três genótipos distintos, W, H e M, observados em diferentes freqüências nas linhagens analisadas. O genótipo homozigoto selvagem (W) foi detectado exclusivamente nas linhagens sensíveis (SD e SM) e em alta freqüência. O genótipo heterozigoto (H) foi detectado em todas as linhagens, porém, em maior freqüência nas linhagens tolerantes (TD e TM) e, o genótipo homozigoto mutante (M) foi observado nas linhagens tolerantes e resistentes, em maior freqüência nas linhagens resistentes (RD e RM), sugerindo que a resistência esteja associada à presença do alelo mutante m (polimorfismo EcoRI). A genotipagem por LIS-SSCP mostrou quatro haplótipos: 1 2, 3 e 4. O haplótipo 1 foi observado apenas nas linhagens sensíveis (SD e SM) e em alta freqüência. O haplótipo 4 foi observado nas linhagens tolerantes e resistentes, com a maior freqüência nas linhagens tolerantes (TD e TM). O haplótipo 3, foi observado nas linhagens tolerantes e resistentes, sendo detectado em maior freqüência nas linhagens resistentes (RD e RM). O haplótipo 2 foi detectado nas linhagens tolerantes e resistentes, porém, em freqüência muito baixa. A comparação entre as seqüências revelou a presença de mutações de ponto, além do polimorfismo EcoRI nas linhagens tolerante e resistente ao malation. Foi observada, também, a presença de códons de parada, gerando proteínas truncadas, nas linhagens sensível e tolerante. A análise de domínios mostrou a presença de domínios adicionais na linhagem resistente. Os dados obtidos sugerem a existência de mecanismos mediados por mutações de ponto, amplificação gênica e modificações pós-traducionais, que podem estar alterando a atividade das proteínas traduzidas e atuando em conjunto na expressão da resistência na população analisada.
Abstract: The cattle tick Boophilus microplus is one of the most important ectoparasites for the Brazilian farming, and it is responsible, according to Agriculture Ministry, for direct and indirect damages to livestock of, approximately, two billions dollars a year. The traditional method of control is based on the intensive use of pyrethroids and organophosphate pesticides, whose systematic use has been promoting the selection of resistant genotypes in tick populations. Point mutations in esterase genes and the increase of production of these enzymes represent important strategies of resistance, conferring insensivity to neurotoxic effects of these organic compounds in this specie. In this work, esterase patterns were compared among the stages of the life cycle of B. microplus, in non-denaturing polyacrilamide gel electrophoresis (PAGE), using specific staining for esterases. Electrophoretical results indicate the presence of nine regions displaying esterase activity. These esterases were considered as products from nine alleles distributed in seven gene loci. Esterases that were detected in all the stages of development were considered as products of housekeeping genes. Some stage-specific and sex-specific esterases were also detected. Strains with different levels of resistance were selected after the resistance test with the malation organophosphate and with the deltametrin pyrethroid in engorged females from a farm of Uberlândia region (MG), with description of resistance. Electrophoretical profiles of esterase pattern using non-denaturing polyacrilamide gel electrophoresis among malathion and deltametrin-susceptible, tolerant and resistant tick strains revealed four bands displaying esterase activity, named EST-1 to EST-4. The esterases EST-3 and EST-4, classified as carboxylesterases, were observed in all strains. The esterase EST-2, classified as an acetylcholinesterase in inhibitor tests, was detected in all strains, but it has presented an increasing degree of staining, from susceptible to resistant strains, indicating an increase in the enzyme production according to resistance level, probably as a result of gene amplification or post-traditional alterations. The enzyme EST-1, classified as an acetylcholinesterase, was detected exclusively in tolerant and resistant strains to both acaricides, however, with higher activity in resistant strains. These data indicate that the detected acetylcholinesterases could xviii be representing important detoxification strategy developed to overcome the effects of the acaricides. These strains were also analyzed by the techniques Low Ionic Strength Single Stranded Conformation Polymorphism (LIS-SSCP) and Polimerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism (PCRRFLP) to investigate mutations in a putative carboxylesterase fragment. The digestion of the amplified fragment of 372bp with the restriction enzyme Eco RI showed three band patterns, associated to three distinct genotypes: W, H and M, which were observed in different frequencies in the analyzed strains. The homozygous wild genotype (W) was detected only in the susceptible strains, in high frequency. The heterozygous genotype (H) was observed in all strains, however, in higher frequency in tolerant strains, and the homozygous mutant genotype (M) was observed only in the resistant and tolerant strains, with higher frequency in the resistant strains, suggesting that the resistance can be associated to the presence of the m mutant allele (EcoRI polymorphism). The genotyping by LIS-SSCP showed four haplotypes, named 1, 2, 3 and 4. The haplotype 1 was observed only in the susceptible strains and in high frequency. The haplotype 4 was observed in the resistant and tolerant strains with higher frequency in tolerant strains. The haplotype 3 was observed in resistant and tolerant strains, and was detected in higher frequency in the resistant strains. The haplotype 2, was also detected in resistant and tolerant strains, however, in very low frequency in population. The comparison among the sequences demonstrated the presence of mutations, beyond the EcoRI polymorphism in resistant and tolerant strains. The presence of stop codons was also observed, creating truncated proteins in the susceptible and tolerant strains. The domains analysis showed additional motifs in resistant strain. The obtained data suggest mechanisms mediated by point mutations, gene amplification and post-traditional modifications, which can be altering the activity of the translated proteins and acting together in the expression of resistance in the analyzed population.
Keywords: Boophilus microplus
Resistência
Acaricidas
Esterases
Resistance
Acaricides
Carrapato bovino
metadata.dc.subject.cnpq: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::GENETICA
metadata.dc.language: por
metadata.dc.publisher.country: BR
Publisher: Universidade Federal de Uberlândia
metadata.dc.publisher.initials: UFU
metadata.dc.publisher.department: Ciências Biológicas
metadata.dc.publisher.program: Programa de Pós-graduação em Genética e Bioquímica
Citation: BAFFI, Milla Alves. Esterases e resistência a acaricidas no carrapato bovino Boophilus microplus (Acari, Ixodidae). 2006. 113 f. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas) - Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 2006.
URI: https://repositorio.ufu.br/handle/123456789/15691
Issue Date: 20-Jan-2006
Appears in Collections:TESE - Genética e Bioquímica

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