Please use this identifier to cite or link to this item: https://repositorio.ufu.br/handle/123456789/15688
metadata.dc.type: Tese
metadata.dc.rights: Acesso Aberto
Title: Identificação e caracterização de biomarcadores teciduais e sorológicos no câncer de mama por Phage Display
metadata.dc.creator: Sousa, Cristina Soares de
metadata.dc.contributor.advisor1: Bonetti, Ana Maria
metadata.dc.contributor.advisor-co1: Goulart Filho, Luiz Ricardo
metadata.dc.contributor.referee1: Arap, Marco Antonio
metadata.dc.contributor.referee2: Ávila, Veridiana de Melo Rodrigues
metadata.dc.contributor.referee3: Kerr, Warwick Estevam
metadata.dc.contributor.referee4: Rocha, José Cláudio Casali da
metadata.dc.description.resumo: CAPITULO II: O câncer de mama é uma das principais causas de morte em mulheres e ainda não existem medidas específicas de prevenção primária. A detecção precoce é o objetivo principal, visando à diminuição da mortalidade e aumento da sobrevida. Nesse trabalho foi utilizada a técnica de Phage Display para isolar peptídeos ligantes às proteínas do tecido câncer de mama para obtenção de biomarcadores que possam ser utilizados no diagnóstico e tratamento dessa patologia. Para seleção desses peptídeos foi realizado um Bioppaning subtrativo, no qual duas bibliotecas de peptídeos Ph.D.-7 e Ph.D.-12 expressas na superfície de fago filamentoso M13 foram colocadas primeiramente em contato com proteínas de tecido de mama normal, para que os fagos ligantes a proteínas do tecido normal fossem eliminados nessa etapa, e depois foram submetidas a três ciclos de seleção. O DNA dos fagos selecionados foi seqüenciado e traduzido. As seqüências peptídicas selecionadas foram analisadas por bioinformática e pelas técnicas ELISA, dot-blotting, wertern-blotting e imunohistoquímica para confirmar o sucesso da estratégia de seleção e para fornecer novos subsídios quanto aos prováveis alvos biológicos. A análise imunohistoquímica foi realizada com seis dos fagos selecionados (BC04, BC05, BC07, BC11, BC12, BC17) em câncer de mama e com a mistura de três deles (BC11, BC12, BC17), em câncer de mama, câncer de ovário, linfoma não-hodgkin e melanoma. Todos os fagos selecionados apresentaram alto grau de informação e Razão do Indice ELISA acima de 1, o que é considerado significativo. Tanto em Dot-blotting quanto em wertern-blotting, os fagos se ligaram apenas a proteínas do tumor. Na imunohistoquímica pode-se observar marcação apenas de células tumorais. A mistura de fagos reconheceu proteínas do câncer de mama, câncer de ovário e linfoma maligno não-Hodgkin e não reconheceu proteínas do melanoma. Três fagos selecionados, BC04, BC05 e BC07 marcaram especificamente a parede vascular de células tumorais. Os fagos selecionados nesse trabalho podem, em um futuro próximo, ser utilizados como biomarcadores teciduais, podendo ajudar tanto no diagnóstico, quanto no tratamento do câncer de mama. O elevado grau de informação de cada peptídeo selecionado obtido pelas análises de bioinformática e os resultados obtidos nos testes ELISA, Dotblotting, Western-blotting e imunohistoquímica validam os dados de bioppaning subtrativo e comprovam a eficiência da técnica de Phage Display. CAPITULO III: No Brasil, o câncer de mama é a patologia maligna mais frequente na população feminina e tem o seu quadro agravado pelo fato do diagnóstico ser estabelecido, na maioria das vezes, em fase tardia da doença. Nesse trabalho foi utilizada a técnica de Phage Display para isolar peptídeos ligantes às proteínas do soro de mulheres com câncer de mama para obtenção de biomarcadores que possam ser utilizados no diagnóstico sorológico dessa patologia. Para seleção dos peptídeos foi realizado um bioppaning subtrativo utilizando uma biblioteca de peptídeos Ph.D.-12 expressa na superfície do fago filamentoso M13. A biblioteca de fagos foi colocada, primeiramente, em contato com soro de mulheres clinicamente sadias, depois em contato com soro de mulheres com doenças benignas de mama, e por último, em contato com soro de mulheres com câncer de mama, para que os fagos ligantes a proteínas do soro de mulheres sem a patologia ou com doença benigna fossem eliminados. O DNA dos fagos selecionados foi seqüenciado e as seqüências analisadas por bioinformática. As técnicas ELISA e dot-blotting foram utilizadas para confirmar o sucesso da seleção. Todos os clones analisados apresentaram Razão do Índice ELISA maior do que um e alto grau de informação. A seqüência IETYESTHQSPP foi a mais frequente e apresentou alta reatividade nas análises de dot-blotting com IgGs do soro de pacientes com câncer de mama. Os clones T03, T18 e T09 apresentaram similaridade com a Ubiquitina e os clones T06, T19, T04, T10, T11, T14, T17 com motivos Zinc Finger. O fato de diferentes clones apresentarem similaridade para um mesmo tipo de proteína sugere que diferentes motivos de uma mesma proteína podem ser epítopos reconhecidos por autoanticorpos ou que esses motivos estejam interagindo com proteínas associadas ao câncer de mama, visto que o bioppaning foi feito com soro total.
Abstract: CHAPTER II: Breast cancer is one of the main causes of death among women, as there is no primary prevention. Early detection is the main objective aiming decrease mortality and increase survival. We used phage display technology to isolate ligand peptides to breast cancer tissues in order to select potential biomarkers for the improvement of diagnosis and treatment. Two random peptide libraries with seven and twelve residues expressed in fusion with the pIII protein of the M13 bacteriophage, Ph.D.-7 and Ph.D.-12, respectively, were firstly submitted to a pre clearing by placing them in contact with proteins of normal breast tissues, in oder to eliminate peptides that may recognize healthy tissues. Remaining phages in the supernatant was further selected through three rounds of positive selection. DNA of selected phage were sequenced and translated. Peptide sequences were then submitted to bioinformatic analyzes, ELISA, Dot-blotting, western-blotting and immunohistochemistry assays to confirm the selection strategy and to provide further evidences of the putative biological targets. The immunohistochemistry analysis was performed with six selected phage (BC04, BC05, BC07, BC11, BC12, BC17) in breast cancer, and a mixture of three phage (BC11, BC12, BC17) has been tested in breast and ovary cancers, non-Hodgkin lymphoma, and melanoma. All phages presented high information content with significant ELISA indexes. The Dot-blotting and western-blotting assays have validated the selection by demonstrating high specificity to tumor proteins. The immunohistochemistry analyzes have shown specific binding only to tumor cells. The mixture of phages has recognized all types of tumor tissues, except melanoma. Three selected phage, BC04, BC05 and BC07 have specifically marked the vascular walls of tumor cells. The selected phage may be used in the future as tissue biomarkers for diagnosis and therapeutic procedures in breast cancer. The high information content and the significant data presented by all immunological assays have validated the Phage Display subtractive selection strategy. CHAPTER III: Breast cancer is the most frequent malignant pathology in the Brazilian women population, which is aggravated by diagnosis in later stages of the disease. The aim of this investigation was to select and identify ligand peptides to serum proteins of women with breast cancer through phage display in order to use them as serological biomarkers. Selection of phages was performed in three steps using a random peptide library of 12 residues (Ph.D.-12). The first two selection steps consisted of a pre clearing using the phage libraries against sera proteins of healthy individuals, followed by a second selection against sera proteins of patients with benign breast diseases. After subtraction, the library was submitted to a positive selection against sera of patients with breast cancer. Phage ligands were selected, amplified, and the DNA was sequenced and translated. Peptide sequences were subimtted bioinformatic analyses and to ELISA and dot-blotting assays to confirm selection success. All clones presented significant ELISA indexes and a high information content. The sequence IETYESTHQSPP was the most frequent and presented a high reactivity against IgG from breast cancer patients´ in the dot-blotting analysis. Clones T03, T18 and T09 presented similarity with the ubiquitin and clones T06, T19, T04, T10, T11, T14, T17 with zinc finger motifs. The fact of different clones to present similarity for the same type of protein suggests that different motifs of one same protein can be epitopes recognized by auto-antibodies or that these motifs are interacting with proteins associated to breast cancer, since biopanning was made with total serum.
Keywords: Câncer de mama
Breast cancer
Mama - Câncer
Phage Display
metadata.dc.subject.cnpq: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::GENETICA
metadata.dc.language: por
metadata.dc.publisher.country: BR
Publisher: Universidade Federal de Uberlândia
metadata.dc.publisher.initials: UFU
metadata.dc.publisher.department: Ciências Biológicas
metadata.dc.publisher.program: Programa de Pós-graduação em Genética e Bioquímica
Citation: SOUSA, Cristina Soares de. Identificação e caracterização de biomarcadores teciduais e sorológicos no câncer de mama por Phage Display. 2007. 111 f. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas) - Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 2007.
URI: https://repositorio.ufu.br/handle/123456789/15688
Issue Date: 16-Feb-2007
Appears in Collections:TESE - Genética e Bioquímica

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
Cristina Soares.pdf1.16 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.