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metadata.dc.type: Dissertação
metadata.dc.rights: Acesso Aberto
Title: Imobilização e estabilização de β-galactosidase por ligações multipontuais em Duolite A568
Imobilização e estabilização de β-galactosidase por ligações multipontuais em Duolite A568
metadata.dc.creator: Falleiros, Larissa Nayhara Soares Santana
metadata.dc.contributor.advisor1: Ribeiro, Eloizio Julio
metadata.dc.contributor.referee1: Resende, Miriam Maria de
metadata.dc.contributor.referee2: Cardoso, Vicelma Luiz
metadata.dc.contributor.referee3: Kamimura, Eliana Setsuko
metadata.dc.description.resumo: A enzima β-galactosidase tem apresentado uso crescente na indústria de laticínios, visto que a mesma pode ser utilizada para produzir uma mistura isomolecular de glicose e galactose, além de possuir uma grande aplicação biotecnológica na produção de leite com baixo teor de lactose e na produção de galacto-oligossacarídeos a partir da lactose do soro, que está disponível em abundância como um subproduto da indústria de queijo. Tem-se ainda um grande interesse na estabilização da enzima imobilizada através de ligações covalentes multipontuais, visto que estas ligações podem aumentar a rigidez da enzima e, por consequência, aumentar a estabilidade frente a agentes inativantes. Neste trabalho foram estudadas a imobilização e estabilização de β-galactosidase em resina de troca iônica, com e sem cross-linking, utilizando glutaraldeído. O processo de imobilização consistiu na adsorção da enzima na resina de troca iônica Duolite A-568 e a estabilização do derivado enzimático foi realizado através da incubação do mesmo em tampão pH 9 a 25°C ± 1°C por 24h. Foi avaliada a influência da ordem das etapas de obtenção do biocatalisador imobilizado, bem como a influência do tampão utilizado e o efeito da presença do substrato no processo de obtenção do mesmo. A estabilidade do biocatalisador obtido foi avaliada em relação ao pH, à temperatura e à estocagem. A enzima imobilizada foi empacotada em um reator de leito fixo com reciclo operando em regime contínuo, com intuito de avaliar o processo hidrólise neste tipo de reator em função da razão de reciclo utilizada. Estudou-se a estabilidade operacional do biocatalisador durante 800 tempos de residência em reator contínuo. Os resultados indicaram que o método de obtenção de β-galactosidase de Aspergillus oryzae imobilizada em Duolite A568 que resultou na maior atividade catalítica foi a sequência dos processos de imobilização por adsorção, seguido da etapa de estabilização e finalmente submetida ao processo de ligação cruzada com glutaraldeído, promovendo um aumento de 44% da atividade enzimática, quando comparado com a atividade alcançada pelo biocatalisador obtido pelos processos de adsorção e cross-linking. O emprego do tampão borato reduziu a atividade em aproximadamente 70% quando comparado com a atividade do derivado obtido utilizando tampão fosfato. A adição da lactose como composto protetor do sítio ativo da enzima durante a imobilização não alterou o desempenho do biocatalisador, mostrando que o sítio ativo não está diretamente envolvido no processo de imobilização. O biocatalisador obtido pela combinação dos processos de adsorção, estabilização e ligação cruzada mostrou-se altamente estável em toda a faixa de pH estudada. Foi verificada uma forte dependência da enzima imobilizada em relação à temperatura. Para as temperaturas de 60, 57,5 e 55°C foi observado um patamar de estabilidade até os 30 minutos de incubação, a partir daí observa-se o processo de inativação térmica. Para a temperatura de 55°C, após 140 minutos o biocatalisador reteve 77% da atividade em relação à inicial. O modelo de desativação térmica de primeira ordem foi o que melhor se ajustou aos resultados experimentais para descrever a cinética de desativação térmica da enzima imobilizada. A energia de ativação do processo de desativação térmica de β-galactosidase de Aspergillus oryzae imobilizada foi 71,03 kcal/mol com tempos de meia vida de 5,5 horas a 55°C. A enzima imobilizada manteve sua atividade após 100 dias de armazenamento, em tampão acetato pH 4,5 a 4 ± 2°C. A razão de reciclo igual a 0,5 promoveu um incremento de aproximadamente 40% da conversão global quando comparado como a conversão por passe alcançada para a mesma condição de operação.
Abstract: β-galactosidase has presented increased use in the dairy industry, since it can be used to produce a isomolecular mixture of glucose and galactose and also has wide application in biotechnological production of milk with a low-lactose content and in production of galactooligosaccharides from whey lactose, which is abundantly available as a byproduct of the dairy industry. Having a great interest in the stabilization by multipoint covalent attachment of the enzyme immobilized, since these bonds can increase stiffness of the enzyme and, therefore, increase the stability against inactivating agents. In this work was studied the immobilization and stabilization of β-galactosidase using as carrier the ion exchange resin Duolite A568, with and without cross-linking using glutaraldehyde. The immobilization process was constituted by adsorption of the enzyme in Duolite A-568 and the stabilization procedure was performed by incubation of the biocatalyst in buffer pH 9 at 25 ° C ± 1 ° C for 24h. Was evaluated the influence of the steps s order to obtain the immobilized biocatalyst, as well as the influence of buffer used and the presence of the substrate in the process of obtaining biocatalyst. The stability of the biocatalyst obtained was evaluated with respect to pH, temperature and storage. The immobilized enzyme was packed in a fixed bed reactor with recycle operating in continuous, in order to assess the hydrolysis process this type of reactor as a function of recycle ratio used. Was studied the operational stability of the biocatalyst during 800 residence time in the reactor. The results indicated that the production s method to immobilize β-galactosidase from Aspergillus oryzae on Duolite A568 which improvement the catalytic activity was the result of the immobilization process by adsorption, followed by stabilization step, and finally subjected to the process of cross-linking with glutaraldehyde, promoting an increase of 44% enzyme activity compared with the activity achieved by the biocatalyst obtained by the processes of adsorption and cross-linking. The use of borate buffer reduced the activity by approximately 70% compared with the activity obtained by using phosphate buffer. The addition of lactose as a protective compound the active site of the enzyme during immobilization did not alter the performance of the biocatalyst, showing that the active site is not directly involved in the process of immobilization. The biocatalyst obtained by the combination of adsorption processes, stabilization, and crosslinking was highly stable over the entire pH range studied. It was observed a strong dependence of the immobilized enzyme in relation to temperature. At temperatures of 60, 57,5 and 55 °C there was a level of stability to the 30 minutes of incubation, from there one can observe the thermal inactivation process. At 55 °C after 140 minutes, the biocatalyst retained 77% its activity relative to baseline.The model of thermal deactivation of the first order was the best fit to the experimental results to describe the kinetics of thermal deactivation of the immobilized enzyme. The activation energy of thermal deactivation process of β- galactosidase from Aspergillus oryzae immobilized was 71,03 kcal/mol with half-lives of 5,5 hours at 55 °C. The immobilized enzyme retained its activity after 100 days of storage in acetate buffer pH 4.5 at 4 ± 2 ° C. The recycle ratio of 0,5 promoted an increase of approximately 40% of the overall conversion as compared to the conversion per pass achieved for the same operating condition.
Keywords: β-galactosidase
Hidrólise de lactose
Imobilização
Estabilização
Ligação covalente multipontual
Duolite A568
Reator de leito fixo com reciclo
Lactose hydrolysis
Immobilization
Stabilization
Covalent multipoint
Fixed bed reactor with recycle
Enzimas - Aplicações industriais
Enzimas imobilizadas
metadata.dc.subject.cnpq: CNPQ::ENGENHARIAS::ENGENHARIA QUIMICA
metadata.dc.language: por
metadata.dc.publisher.country: BR
Publisher: Universidade Federal de Uberlândia
metadata.dc.publisher.initials: UFU
metadata.dc.publisher.department: Engenharias
metadata.dc.publisher.program: Programa de Pós-graduação em Engenharia Química
Citation: FALLEIROS, Larissa Nayhara Soares Santana. Imobilização e estabilização de β-galactosidase por ligações multipontuais em Duolite A568. 2012. 127 f. Dissertação (Mestrado em Engenharias) - Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 2012.
URI: https://repositorio.ufu.br/handle/123456789/15186
Issue Date: 26-Jul-2012
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