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metadata.dc.type: Tese
metadata.dc.rights: Acesso Embargado
Title: Produção e caracterização de B-galactosidase de Kluyveromyces marxianus ATCC 46537
metadata.dc.creator: Falleiros, Larissa Nayhara Soares Santana
metadata.dc.contributor.advisor1: Ribeiro, Eloizio Julio
metadata.dc.contributor.advisor-co1: Resende, Miriam Maria de
metadata.dc.contributor.referee1: Melo, Claudia Maria Tomás
metadata.dc.contributor.referee2: Fernandes, Gislaine
metadata.dc.contributor.referee3: Coutinho Filho, Ubirajara
metadata.dc.contributor.referee4: Cardoso, Vicelma Luiz
metadata.dc.contributor.referee5: Silva, Helisangela de Almeida
metadata.dc.description.resumo: A enzima β-galactosidase tem apresentado uso crescente na indústria de laticínios, visto que a mesma pode ser empregada na prodrução de uma mistura isomolecular de glicose e galactose, além de possuir uma grande aplicação biotecnológica na produção de leite com baixo teor de lactose, na produção de galacto-oligossacarídeos a partir da lactose do soro e como etapa preliminar para síntese de d-tagatose. Têm-se ainda um grande interesse na otimização das condições de fermentação e composição do meio para aumentar a produção de β-galactosidase, a fim de alcançar um elevado rendimento de produção de baixo custo. A levedura Kluyveromyces marxianus é uma importante levedura industrial para fermentação de lactose, tendo aplicações clássicas na produção de biomassa, etanol e enzimas. Neste trabalho foi estudada a produção e caracterização da enzima β-galactosidase de K. marxianus ATCC 46537 produzida por fermentação de permeado de soro de leite. As fermentações utilizaram meio à base de permeado de soro de leite e as análises de etanol e açúcares foram feitas por cromatografia líquida. A atividade enzimática foi determinada pelo método das taxas iniciais e a glicose formada era dosada por glicose-oxidase. A unidade de atividade enzimática U mL-1 foi definida como μmol de glicose produzida por minuto, por mL de suspensão enzimática, à temperatura de 30 °C, pH 6,5, com uma concentração inicial de lactose de 50 g L-1. O meio para obtenção do inóculo foi o meio composto por extrato de levedura (6,0 g L-1), (NH4)2SO4 (6,0 g L-1), KH2PO4 (5,0 g L-1), MgSO4.7H2O (0,6 g L-1) e permeado de soro de leite em pó (concentração de lactose 50 g L-1), preparado em tampão fosfato 10-1 M pH 5,5. Foi estudada a cinética de crescimento da levedura e obteve-se o valor da μmax de 0, 288 h-1 e tempo de geração nesta fase de 2,41 horas. Diferentes métodos de extração de β-galactosidase foram avaliados, sendo a extração em agitador tipo vórtex e em processador ultrassônico os que apresentaram os melhores resultados. Foi realizado um Planejamento Fatorial Fracionário para estudar a influência do pH e composição do meio na produção de β-galactosidase e obteve-se que, a produção de β-galactosidase foi afetada de modo mais significativo por lactose, seguido de (NH4)2SO4, extrato de levedura e pH. A composição do meio fermentativo foi avaliada por um Delineamento Composto Central para a síntese de β-galactosidase e os melhores resultados foram alcançados para as concentrações de lactose variando de 100 a 150 g L-1, extrato de levedura inferior a 6 g L-1 e (NH4)2SO4 entre 2 e 8 g L-1. A influência conjunta da velocidade de agitação e taxa de aeração foi avaliada pela realização de Delineamento Composto Central que obteve atividade enzimática de 139,58 U mLcaldo-1 no ponto central (250 rpm e 0,75 vvm). Avaliou-se a co-produção de bioetanol por fermentação do permeado de soro de leite usando K. marxianus. O maior valor observado para concentração de bioetanol (36,94 g L-1) foi obtido na fermentação em que utilizou-se da velocidade de agitação de 427 rpm e taxa de aeração de 0,24 vvm, o que implica em um rendimento de 72,3%. Verifica-se, pela análise conjunta das regiões ótimas para as respostas atividade enzimática e co-produção de bioetanol, que há faixas das regiões que implicam em altos valores de atividade enzimática e bioetanol simultaneamente, sendo elas: agitação de 200 a 400 rpm com aeração entre 0,4 a 1,2 vvm. Estes resultados indicam uma alternativa promissora para a valorização do permeado de soro de leite na produção conjunta de β-galactosidase e bioetanol. O extrato enzimático produzido foi caracterizado e as constantes cinéticas obtidas para Vmáx e Km foram, respectivamente, 11,01 U mL-1 e 3,62 g L-1. A enzima produzida apresentou maior atividade a uma temperatura de 45 °C e obteve-se altos valores de atividade relativa em tampão lático na faixa de pH de 5,5 a 7,3. A eletroforese em gel de poliacrilamida do extrato enzimático apresentou uma subunidade de massa molecular 52,3 kDa coincidente com a amostra de referência (Lactozyme® 2600) indicando a presença de subunidades de β-galactosidase no extrato produzido.
Abstract: β-galactosidase has presented increased use in the dairy industry, since it can be used to produce a isomolecular mixture of glucose and galactose and also has wide application in biotechnological production of milk with a low-lactose content, in production of galacto-oligosaccharides from whey lactose and as a preliminary step to d-tagatose synthesis. Exist still a great interest in the optimization of fermentation conditions and of medium composition to increase the production of β-galactosidase in order to achieve a high yield of low cost production. The yeast Kluyveromyces marxianus is an important industrial yeast for fermentation of lactose, having classic applications in the production of biomass, ethanol and enzymes. In this work the production and characterization of β-galactosidase from K. marxianus ATCC 46537 produced by fermentation of whey permeate were studied. The fermentation medium used was based in permeate whey and analysis of sugars and ethanol were made by liquid chromatography. Enzymatic activity was determined by the initial rates and glucose formed was measured by glucose oxidase. The enzyme activity unit (U mL-1) was defined as μmol of glucose produced per minute per mL enzyme suspension at a temperature of 30 °C, pH 6.5, with an initial lactose concentration of 50 g L-1. The medium to obtain inoculum was the medium composed of yeast extract (6.0 g L-1), (NH4)2SO4 (6.0 g L-1), KH2PO4 (5,0 g L-1), MgSO4.7H2O (0.6 g L-1) permeate whey (lactose concentration of 50 g L-1) prepared in phosphate buffer 10-1 M pH 5.5. Was studied the growth kinetic of the yeast and was obtained the μmax of 0, 288 h-1 and generation time of 2.41 hours in this stage. Different methods of β-galactosidase extraction were evaluated and the extraction by vortex agitator and ultrasonic processor were who showed the best results. A Fractional Factorial Design was performed to study the influence of pH and medium composition on the production of β-galactosidase for which it was obtained that the maximum production of β-galactosidase was affected more significantly by lactose, followed by (NH4)2SO4, yeast extract and pH. The fermentative medium composition was evaluated using a Central Composite Design, the best results were obtained for lactose concentrations ranging from 100 to 150 g L-1, yeast extract lower than 6 g L-1 and (NH4)2SO4 between 2 and 8 g L-1. The simultaneous influence of agitation speed and aeration rate was evaluated by performing a Central Composite Design that resulted in enzymatic activity of 139.58 U mLfermented broth-1 at the central point (250 rpm and 0.75 vvm). Was evaluated the co-production of bioethanol by fermentation of whey permeate by using K. marxianus. The highest value observed for bioethanol concentration (36.94 g L-1) was obtained in the fermentation in which was used agitation speed of 427 rpm and aeration rate of 0.24 vvm, which implies a yield of 72.3 %. Was verified, by simultaneous analysis of the optimum regions for the answers of enzyme activity and bioethanol co-production, regions that imply high values for enzymatic activity and bioethanol, simultaneously, as follows: agitation speed 200-400 rpm with rate aeration of 0.4 to 1.2 vvm. These results indicate a promising alternative for the valorization of whey permeate in the simultaneous production of β-galactosidase and bioethanol. The enzyme extract produced were characterized and the kinetic constants obtained for Vmax and Km were respectively 11.01 U mL-1 and 3.62 g L-1. The produced enzyme was most active at a temperature of 45 °C and obtained high values of relative activity in lactic acid buffer at pH 5.5 to 7.3. The polyacrylamide gel electrophoresis the enzyme extract showed a subunit molecular mass of 52.3 kDa coincident with the reference sample (Lactozyme® 2600) indicating the presence of β-galactosidase subunits produced in the extract.
Keywords: B-galactosidase
Kluyveromyces marxianus
Permeado de soro de leite
Bioetanol
Whey permeate
Bioethanol
metadata.dc.subject.cnpq: CNPQ::ENGENHARIAS::ENGENHARIA QUIMICA
metadata.dc.language: por
metadata.dc.publisher.country: BR
Publisher: Universidade Federal de Uberlândia
metadata.dc.publisher.initials: UFU
metadata.dc.publisher.department: Engenharias
metadata.dc.publisher.program: Programa de Pós-graduação em Engenharia Química
Citation: FALLEIROS, Larissa Nayhara Soares Santana. Produção e caracterização de B-galactosidase de Kluyveromyces marxianus ATCC 46537. 2016. 150 f. Tese (Doutorado em Engenharias) - Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 2016.
URI: https://repositorio.ufu.br/handle/123456789/15094
Issue Date: 15-Apr-2016
Appears in Collections:TESE - Engenharia Química

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