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metadata.dc.type: Dissertação
metadata.dc.rights: Acesso Aberto
Title: Produção e aplicação de imunoglobulinas y anti-Leptospira spp
Other Titles: Production and application of immunoglobulin y anti-leptospira spp
metadata.dc.creator: Tavares, Tatiane Cristina Fernandes
metadata.dc.contributor.advisor1: Ribeiro, Anna Monteiro Correia Lima
metadata.dc.contributor.referee1: Medeiros, Alessandra Aparecida
metadata.dc.contributor.referee2: Bittar, Joely Ferreira Figueiredo
metadata.dc.contributor.referee3: Santos, Ricarda Maria dos
metadata.dc.description.resumo: A dissertação foi dividida em dois estudos. No primeiro estudo objetivou-se verificar se galinhas imunizadas com uma solução de Leptospiras inativadas e proteínas de membrana externa do sorovar Hardjo, poderiam produzir anticorpos policlonais específicos anti-Leptospiras, detectáveis em testes ELISA. Foram imunizados oito galinhas com 25 semanas de idade, da raça White Leghorn, sendo três imunizadas com uma suspensão de Leptospiras inativadas, três com uma solução de proteínas de membrana externa extraída do sorovar Hardjo e duas controle. Coletas de sangue foram realizadas quinzenalmente e de ovos diariamente. A IgY foi purificada a partir da gema dos ovos utilizando para a delipidação o método de diluição em água ácida e a precipitação com sulfato de amônio. Realizou-se testes ELISA para verificar a especificidade da IgY, nestes foi possível observar a produção de anticorpos anti-Leptospira, tanto no soro quanto nas gemas purificadas. O pico de produção de anticorpos específicos ocorreu na 5º semana após a primeira imunização. Foi possível induzir a produção de anticorpos específicos em galinhas, por meio de imunizações destas com Leptospira inativada e proteínas de membrana externa do sorovar Hardjo. Galinhas imunizadas com uma suspensão de Leptospiras inativadas e com PME de Leptospira interrogans do sorovar Hardjo produziram anticorpos reativos a PME Hardjo detectáves por teste ELISA. No segundo estudo objetivou-se com identificar epítopos ou mimetopos (sequências que imitam epítopos verdadeiros), por meio da técnica de phage display tendo como alvo anticorpos IgY anti-Leptospira e anti-PME Hardjo. Os anticorpos IgY utilizados como alvo foram produzidos em galinhas imunizadas com proteínas de membrana externa de Leptospira interrogans sorovar sorovar Hardjo (anti-PME Hardjo), suspensão de Leptospiras inativada (anti-Leptospira) e IgY controle. No biopanning uma biblioteca comercial de peptídeos randômicos Ph.D. 12 mer, New England BioLabs®Inc foi incubada primeiramente com a IgY controle, realizando um processo denominado seleção negativa e depois com a IgY anti-Leptospira e anti-PME Hardjo, a eluição dos fagos selecionados foi então realizada de forma competitiva e ácida. Após três ciclos de seleção, 288 clones foram isolados e sequenciados, gerando 132 sequências válidas. Os clones foram submetidos a testes ELISA com o anticorpo usado como alvo no biopanning para verificar a especificidade destes. Nos resultados dos testes ELISAs verificou-se que nove fagos (PMEcomp17, PMEac10, PMEac12, PMEac19, PMEac29, PMEac35, Lep6, Lep7 e Lep20) apresentaram melhores resultados. Estes foram alinhados com a sequência primária de proteínas de Leptospira spp e Leptospira interrogans sorovar Hardjo, e as análises in Silico mostraram que os nove peptídeos têm similaridade com proteínas imunogênicas de Leptospiras. Foram selecionados nove peptídeos com similaridade a proteínas de Leptospira interrogans consideradas imunogênicas. Os peptídeos foram similares a proteínas de membrana externa, lipoproteína, LipL32, LipL41, LigA, SecY, LenE.
Abstract: The dissertation was divided in two chapters. The aim was to determine whether hens immunized with an inactivated suspension of Leptospira and a solution of outer membrane proteins extracted from the serovar Hardjo, could produce specific polyclonal antibodies to Leptospira, detected in ELISA assay. Eight hens White Leghorn race with 25-weeks-old were immunized, three with an inactivated suspension of Leptospira, three with a solution of outer membrane proteins (OMP) extracted from the serovar Hardjo and two controls immunized with saline. Blood samples were collected fortnightly and eggs daily. The IgY was purified from the egg yolk using the method for the delipidation of dilution with water acidic and ammonium sulfate precipitation. The ELISA assay was performed to verify the specificity of the IgY, these was possible to observe the production of specific antibody to Leptospira both in serum and purified egg yolk. The specific antibody titers peaked in the fifth week post immunization. The production of polyclonal IgY was effective for producing high titers of specific antibodies. The aim of the second chapter was search to epitopes or mimetops (mimetic sequence of the true epitopes) through technique of phage display using IgY specific to Leptospira, outer membrane proteins the serovar Hardjo and IgY control. To realize the biopanning was used a commercial library of random peptides Ph.D. 12 mer, New England BioLabs®Inc Phage Display Library was first incubated with IgY control, performing a process called negative selection, and then with IgY specific to Leptospira and to OMP Leptospira Hardjo, selected phages were eluted competitively and acid. After three rounds of selection, 288 clones were isolated and sequenced, generating 132 valid sequences. The selected clones were tested in diagnosis by ELISA assay with the antibody used as a biopanning target in order to verify the specificity of these. The results of ELISA testing it was found that nine phage (PMEcomp17, PMEac10, PMEac12, PMEac19, PMEac29, PMEac35, Lep6, Lep7 e Lep20) showed better results. These were aligned with the primary sequence of proteins of Leptospira spp. and Leptospira interrogans serovar Hardjo and insilico analyzes showed that nine peptides has similarity with immunogenic proteins of Leptospira. In this work we selected nine peptides with similarity to proteins of Leptospira interrogans that were considered immunogenic. The peptides were similar to outer membrane proteins, lipoprotein, LipL32, LipL41, LigA, SecY, LenE.
Keywords: Imunoglobulinas
Galinhas
Diagnóstico
Vacinas
Leptospira interrogans
Hens
Page display
Diagnostics
Vacines
Leptospira interrogans
metadata.dc.subject.cnpq: CNPQ::CIENCIAS AGRARIAS::MEDICINA VETERINARIA
metadata.dc.language: por
metadata.dc.publisher.country: BR
Publisher: Universidade Federal de Uberlândia
metadata.dc.publisher.initials: UFU
metadata.dc.publisher.department: Ciências Agrárias
metadata.dc.publisher.program: Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias
Citation: TAVARES, Tatiane Cristina Fernandes. Production and application of immunoglobulin y anti-leptospira spp. 2012. 87 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Agrárias) - Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 2012.
URI: https://repositorio.ufu.br/handle/123456789/13048
Issue Date: 6-Jul-2012
Appears in Collections:DISSERTAÇÃO - Ciências Veterinárias

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