Publicação: Solubilização e efeito de tapsigargina em Ca2+-ATPase de larva de Pachymerus nucleorum (Fabricius 1792) (Coleoptera: Chrysomelidae: Bruchinae)
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CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::GENETICA
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CAPITULO I: Pachymerus nucleorum Fabricius 1792 é uma espécie de besouro predador
de castanhas de babaçu (Orbignya sp.) pertencente à subfamília de coleópteros
Bruchinae, cujos representantes são conhecidos como broc as de sementes. Uma
fração precipitada (P3) obtida a paritr de larva de P. nucleorum e não solubilizada
com Triton X100 apresentou atividade Ca2+-ATPásica e K+/EDTA-ATPásica. O
presente trabalho teve como objetivo solubilizar a enzima responsável pela ativ idade
ATPásica e caracterizá-la. A atividade Ca2+-ATPásica foi parcialmente solubilizada
com NaCl 600 mM e a análise em SDS-PAGE mostrou a presença mais marcante
de um polipeptídeo com mobilidade relativa de 205 kDa, e mais fracamente um de
130 kDa e um de 102 kDa. NaCl 600 mM inibiu cerca de 40% da atividade de P3,
chegando a 84% com NaCl 2M. A atividade Mn2+-ATPásica da fração solubilizada
representou cerca de 40% da Ca2+-ATPásica, e não foi detectada atividade Mg2+-
ATPásica. Em presença de zinco ou ferro oxidado, a atividade ATPásica foi nula e
quando incubada com cobalto, cobre, bário, lítio ou ferro reduzido, a atividade
correspondeu a menos de 20% da Ca2+-ATPásica. A atividade Ca2+-ATPásica foi
completamente inibida por magnésio, cobre e zinco. Cobalto, manganês, ferro
(oxidado e reduzido) inibiram em mais de 60% tal atividade, e bário ou lítio não
afetaram a atividade dependente de cálcio. Neste trabalho, a atividade Ca2+-
ATPásica de larva de Pachymerus nucleorum foi parcialmente solubilizada com
NaCl 600 mM e apresentou atividade Ca2+-ATPásica inibida por magnésio. CAPITULO II: Ca2+-ATPases são ATPases envolvidas no transporte de cálcio através de
membranas. As Ca2+-ATPases de retículo sarcoplasmático e endoplasmático são
irreversivelmente inibidas por concentrações micromolares de tapsigargina. O
objetivo deste trabalho foi testar o efeito de tapsigargina na atividade Ca2+-ATPásica
isolada a partir de larva de Pachymerus nucleorum, um besouro pertencente à
subfamília Bruchinae. As larvas de P. Nucleorum foram homogeneizadas, e a fração
precipitada (fração P3) não solubilizada com Triton X-100 e pirofosfato, foi utilizada
para os testes de inibição por tapsigargina. Tapsigargina 140 μM inibiu cerca de
80% e 95% da atividade Ca2+-ATPásica da fração P3, quando adicionada no início
ou 5 minutos antes de iniciar reação, respectivamente. Pré-incubação com ATP ou
cálcio preveniu parcialmente a inibição da atividade Ca2+-ATPásica por tapsigargina,
assim como pré-incubação na presença de ATP e cálcio. Os resultados mostrados
neste trabalho sugerem que a ATPase isolada de larva de P. Nucleorum trata-se de
uma Ca2+-ATPase.
Abstract
CHAPTER I: Pachymerus nucleorum Fabricius 1792 is a beetle specie that predate babaçu
coconut (Orbignya sp.). It belong to Bruchinae coleoptera subfamily, whose
representants are know as seed bits. We found a precipitated fraction from larvae of
P. nucleorum that is not solubilized by Triton X-100 (P3) and presents Ca2+-ATPase
and K+/EDTA-ATPase activity. The objective of this work was solubilize and
characterize the enzyme responsible for the Ca2+-ATPase activity. The Ca2+-ATPase
was partially solubilized with 600 mM NaCl and the soluble fraction from this assay
(S4) was better characterized. We noticed in SDS-PAGE a strongly stained
polypeptide with 205 kDa and two others with 130 and 102 kDa. 600 mM NaCl
inhibits about 40% of P3 Ca2+-ATPase activity, and 84% with 2 M NaCl. We found in
S4 Mn2+-ATPasic activity, corresponding to 40% of the observed with calcium, and
no Mg2+-ATPase activity was detected. In presence of Zn2+ or Fe2+ the ATPase
activity was null and when incubated with cobalt, copper, barium, litium or Fe 2+, the
ATPase activity correspond to less than 20% of the Ca2+-ATPase activity. The Ca2+-
ATPase activity was completely inhibited by magnesium, copper ou zinc. Cobalt,
manganese, Fe3+ or Fe2+ inhibited in more than 60% such activity, and barium and
litium didn t affect the calcium-dependent activity. In this work, the Ca2+-ATPase
activity of Pachymerus nucleorum larvae was partially solubilized with 600 mM NaCl
and presents Ca2+-ATPase activity inhibited by magnesium. CHAPTER II: Ca2+-ATPases are ATPases involved in transport of calcium across
membranes. Sarcoplasmic and endoplasmic Ca2+-ATPases are irreversibly inhibited
by thapsigargin in micromolar concentrations. The objective of this work was to test
the effect of thapsigargin on Ca2+-ATPase activity isolated from Pachymerus
nucleorum larvae, a beetle especie that belongs to Bruchinae coleoptera subfamily.
The P. nucleorum larvae were homogeneized and the precipitated fraction (P3
fraction) not solubilized with Triton X-100 was used to thapsigargin inhibtion tests.
Thapsigargin 140 μM inhibit about 80% and 90% of Ca2+-ATPase activity of P3,
when added in the begin or 5 minutes before the start reaction, respectivelly. Preincubation
with ATP or calcium partially prevented the inhibition of Ca2+-ATPase
activity. The inhibition was completely prevented with pre-incubation with both ATP e
calcium. The results showed in this work suggest that the ATPase isolated from P.
Nucleorum larvae treats of a Ca2+-ATPase.
Palavras-chave
Pachymerus nucleorum, Larva, Ca2+-ATPase, Solubilização, Tapsigargina, Larvae, Ca2+-ATPase, Solubilization, Thapsigargin, Enzimas
Citação
DUARTE, Vinícius Luis. Solubilização e efeito de tapsigargina em Ca2+-ATPase de larva de Pachymerus nucleorum (Fabricius 1792) (Coleoptera: Chrysomelidae: Bruchinae). 2007. 47 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas) - Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 2007.