Publicação: Fracionamento, deglicosilação química, caracterização parcial e
identificação de antígenos de Strongyloides venezuelensis aplicados no
imunodiagnóstico da estrongiloidíase humana
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CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::IMUNOLOGIA::IMUNOLOGIA APLICADA
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Coorientador
Cunha Junior, Jair Pereira da
Resumo
Strongyloides stercoralis, nematódeo parasito intestinal, infecta milhões de pessoas. A
reatividade cruzada é limitante para o imunodiagnóstico e é atribuída a complexidade
dos preparados antigênicos e às glicoproteínas. Com o objetivo de aprimorar o
imunodiagnóstico da estrongiloidíase humana, este estudo avaliou frações antigênicas
heterólogas obtidas de Strongyloides venezuelensis. O extrato salino (ES) de larvas
filarioides de S. venezuelensis foi fracionado por cromatografia de troca iônica (resina
dietilaminoetil Sepharose DEAE) nas frações DEAE S1 e DEAE S2 que interagiu com a
resina ou de gel filtração (resina Sephacryl S-100) nas frações F1, F2, F3 e F4. Larvas
íntegras e ES foram tratados com metaperiodato de sódio (MP) para deglicosilação
química e verificação de alterações nos carboidratos. O ES e suas frações foram avaliadas
em eletroforese unidimensional para caracterização do perfil proteico e testados em
amostras de soro [pacientes com estrongiloidíase (G1), com outras infecções parasitárias
(G2) e indivíduos saudáveis de área endêmica (G3)] para detecção de IgG e subclasses
anti-Strongyloides por ELISA. Sensibilidade (Se), especificidade (Es), area under curve
(AUC), likelihood ratio (LR), intermediate range (IR) e valid range proportion (VRP) foram
os parâmetros de diagnóstico calculados. A identificação de proteínas de interesse
diagnóstico por espectrometria de massa foi realizada após seleção da fração por ELISAIgG.
Os epítopos de células B foram preditos. DEAE S1 e DEAE S2 apresentaram perfis
proteicos complementares ao do ES, com enriquecimento de polipeptídeos diferencial
(DEAE S1 21 a < 15 kDa; DEAE S2 21 a 50 kDa). A fração DEAE S2 obteve elevado valor
diagnóstico para a detecção de IgG (Se 92 %, Es 93 %, AUC 0,981, LR+ 10,75, LR− 0,09).
Larvas apresentaram marcação modificada para localização de carboidratos e no ES não
foram encontrados carboidratos após MP. Os perfis eletroforéticos dos polipeptídeos
foram semelhantes entre ES antes e após a adição de MP. Sensibilidade no ELISA atingiu
92,5 %, Es 94,6 %, LR+ 16,9 e LR− 0,08 para MP. Interação significante entre subclasses de
IgG e extratos foi demonstrada para pacientes com estrongiloidíase (P = 0,02), com
redução nos níveis detectados. A fração F2 teve bandas marcadas nas regiões de 13, 22,
25, 30, 33, 37, 45, 60, 70 e 140 kDa. Os valores de IR e VRP foram melhores para o teste
ELISA-F2 (IR 23; VRP 98,9 %). A média do índice ELISA (IE) no G1 foi maior para o ES,
quando comparado às frações F1-F4 (P < 0,0001), mas F2 manteve a porcentagem de amostras IgG-positivas (94 %). A redução do IE foi acompanhada da não detecção de IgG
em G2. No G3 apenas F2 mostrou redução de IE em relação ao ES (t = 7,020, P < 0,0001).
Foram selecionadas e excisadas as bandas de aproximadamente 60 e 33 kDa de regiões
polipeptídicas de F2 no gel 1D para análise por espectrometria de massas. Foram
consideradas com identificação confiável três proteínas homólogas de Strongyloides
ratti: aspartic protease 4 (ASP-4), 14-3-3 zeta e heat shock protein 60 (HSP60). Concluiuse
que (1) a fração DEAE S2 demonstrou ser fonte de peptídeos sensíveis e específicos
para detecção de IgG no sorodiagnóstico da estrongiloidíase humana, (2) a deglicosilação
química do antígeno larval diminuiu a reatividade cruzada/ e os falsos positivos nos
grupos controle, demonstrando o papel dos resíduos de carboidratos no reconhecimento
da IgG e suas subclasses anti-Strongyloides e (3) F2, obtida após gel filtração, é composta
por proteínas imunodominantes que permitirão a definição de epítopos para utilização
em ensaios vacinais ou de diagnóstico da estrongiloidíase humana.
Abstract
Strongyloides stercoralis, intestinal nematode parasite, infects millions of people. The
cross-reactivity in immunodiagnosis is credited to antigenic complexity and
glycoproteins. The aim of this study was to evaluate different heterologous antigenic
fractions in human strongyloidiasis immunodiagnosis. Saline extract (SE) of infective
larvae of S. venezuelensis was fractionated in ion exchange resin (diethylaminoethyl
Sepharose - DEAE; fractions named DEAE S1 and DEAE S2 - which interacted with the
resin) or gel filtration chromatography (Sephacryl S-100 resin) in F1, F2, F3 and F4. Larvae
and SE were treated with sodium metaperiodate (MP) for chemical deglycosylation and
verification of changes in carbohydrate content. SE and its fractions were evaluated in
one-dimensional electrophoresis to characterize the proteic profile and were tested in
serum samples [strongyloidiasis patients (G1), other parasitic infections (G2) and healthy
individuals from an endemic area (G3)] for IgG detection and its subclasses by ELISA.
Sensitivity (Se), specificity (Sp), area under curve (AUC), likelihood ratio (LR),
intermediate range (IR) and valid range proportion (VRP) were calculated as diagnostic
parameters. Protein identification by mass spectrometry was made after ELISA-IgG
selection. B cell epitope prediction was performed. DEAE S1 and S2 showed protein
profiles complementary to ES, with differential polypeptides (DEAE S1 - 21 to < 15 kDa;
DEAE S2 - 21 to 50 kDa). DEAE S2 fraction presented higher diagnostic parameters for IgG
detection (Se 92%, Sp 93%, AUC 0.981, LR+ 10.75, LR 0.09). Larvae showed distinct
localization of carbohydrates and no carbohydrates were detected in SE after MPtreatment.
Electrophoretic profiles of polypeptides were similar between SE before and
after MP treatment. ELISA sensitivity reached 90 % for MP, Sp 94.6 %, LR+ 16.9, and LR
0.08. Significant interaction between IgG subclasses and extracts was observed for
patients with strongyloidiasis (P = 0.02), i.e. reduction in detected levels. F2 gel filtration
fraction showed bands of 13, 22, 25, 30, 33, 37, 45, 60, 70 and 140 kDa regions. IR and
VRP values were better for ELISA-F2 (IR 23; VRP 98.9 %). ELISA index (EI) median in G1
was higher for SE when compared to F1-F4 fraction (P < 0.0001), however the F2 retained IgG-positive samples (94%). The EI reduction was accompanied by no detection of IgG
positive samples in G2 and only F2 showed EI reduction in G3 compared to ES IE (t =
7.020, P < 0.0001). Bands 60 and approximately 33 kDa polypeptide regions from F2 were
selected and excised for mass spectrometry analysis. Three homologous proteins of S.
ratti were considered with reliable identification: aspartic protease 4 (ASP-4), 14-3-3 zeta
and heat shock protein 60 (HSP60). It was concluded that: (1) DEAE fraction S2 was a
sensitive and specific source of peptides for IgG detection in human strongyloidiasis
diagnosis, (2) chemical deglycosylation overcome cross-reactivity in the control groups,
demonstrating the role of carbohydrate residues in the recognition of anti-Strongyloides
IgG and its subclasses and (3) F2 obtained after gel filtration, is composed of
immunodominant proteins, which will allow definition of epitopes for vaccine protocols
and diagnostic assays in human strongyloidiasis.
Palavras-chave
Antígeno heterólogo, Cromatografia, Espectrometria de massas, Glicoproteínas, Strongyloides stercoralis, Sorodiagnóstico, Heterologous antigens, Glycoproteins, Chromatography, Mass spectrometry, Serodiagnosis, Estrongiloidíase, Antígenos
Citação
GONZAGA, Henrique Tomaz. Fractionation, chemical deglycosylation, partial characterization and
identification of Strongyloides venezuelensis antigenic fractions in human
Strongyloidiasis immunodiagnosis. 2015. 126 f. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas) - Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 2015. DOI https://doi.org/10.14393/ufu.te.2015.32