Publicação: Imobilização de βeta-galactosidase comercial e produzida por K. marxianus em sílica e avaliação da síntese enzimática de galacto-oligossacarídeos
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CNPQ::ENGENHARIAS::ENGENHARIA QUIMICA
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Coorientador
Ribeiro, Eloízio Júlio
Resumo
A enzima β-galactosidase é amplamente aplicada na indústria, ela realiza a hidrólise da lactose
e também a transgalactosilação, produzindo os galacto-oligossacarídeos (GOS), que possuem
efeitos prebióticos no organismo humano. O uso da β-galactosidase pode apresentar limitações
devido às suas características, como restrição em temperaturas, pHs, impossibilidade de
reutilização dentre outros. A Kluyveromyces lactis e a Kluyveromyces marxianus são leveduras
potenciais na produção de β-galactosidase e interferem nas suas características. Com intuito de
contornar essas limitações nos processos, são utilizados métodos de imobilização de enzimas.
A ligação covalente é um desses processos, ela promove resistência às enzimas imobilizadas
em diferentes condições e reduz perdas por lixiviação. A sílica é um suporte muito utilizado,
pois promove boa ligação da enzima ao suporte. Assim, o objetivo do trabalho foi avaliar a
imobilização de β-galactosidase comercial de K. lactis e β-galactosidase produzida por K.
marxianus em sílica de porosidade controlada e posteriormente realizar a síntese dos galactooligossacarídeos.
Uma avaliação das melhores condições de imobilização da β-galactosidase
comercial foi feita com um Planejamento Composto Central (PCC). O biocatalisador
imobilizado foi avaliado em relação a influência do pH e temperatura na atividade da enzima,
estabilidade térmica, ao pH e armazenamento, reutilização, espectroscopia de infravermelho
com transformada de Fourier (FT-IR) e microscopia eletrônica de varredura (MEV). A hidrólise
da lactose com a enzima imobilizada foi avaliada também em leito fixo. A β-galactosidase
produzida por fermentação submersa da K. marxianus foi avaliada quanto à imobilização em
sílica e em relação algumas técnicas parciais de purificação. A síntese dos galactooligossacarídeos
foi feita com a enzima comercial e produzida em sua forma livre e imobilizada.
A força iônica do tampão foi avaliada na transgalactosilação e um Planejamento Fatorial
Fracionário também foi proposto avaliando a interferência da concentração inicial de lactose,
agitação e temperatura na síntese de GOS. A agitação magnética, mecânica e a configuração de
reator tipo leito fixo também foram avaliadas na síntese dos GOS. As melhores condições de
imobilização foram em concentração de γ-aminopropiltrietoxisilano (APTES) a 1,0%, atividade
inicial da enzima ofertada em 21 U.mL-1 e concentração de glutaraldeído a 6,86%. O
biocatalisador imobilizado apresentou pH ótimo em 7,0, temperatura em 30 °C e estabilidade
em pH 7,5. A estabilidade térmica foi melhor em temperatura mais amena (20 °C). Em 4 ciclos
de reuso a enzima manteve ≈70% da atividade inicial. A enzima armazenada (8 °C) conservou
sua atividade em 44% após 105 dias. O FT-IR permitiu a visualização de grupos da enzima e
da ligação enzima-suporte. As imagens obtidas da MEV evidenciaram a estrutura da sílica. Com
o leito fixo obteve-se uma conversão de lactose de ≈47%. A imobilização da β-galactosidase
produzida com K. marxianus foi limitada e dentre as técnicas de purificação parcial se destacou
o processo de diálise. Os GOS foram produzidos em altas concentrações de lactose (400 g.L-1),
sendo em menor tempo (3 h) para enzima livre e maior para imobilizada (6 h). Os efeitos das
variáveis avaliadas no Planejamento Fatorial Fracionário foram positivos, a influência mais
efetiva foi da agitação, a maior concentração de GOS foi de 67,70 g.L-1. Tanto em agitação
magnética como mecânica foi possível sintetizar os GOS com a enzima imobilizada, as
concentrações de GOS foram de 70,81 e 90,37 g.L-1, respectivamente. Em leito fixo as maiores
concentrações de GOS foram obtidas para coluna empacotada com sílica imobilizada
alcançando valor de 100,18 g.L-1. A enzima produzida por K.marxianus sintetizou GOS em sua
forma livre (106,97 g.L-1). A β-galactosidase imobilizada em sílica é promissora tanto na
hidrólise da lactose como na síntese de GOS.
Abstract
The β-galactosidase enzyme is widely applied in industry. It performs lactose hydrolysis and
also transgalactosylation, producing galactooligosaccharides (GOS), which have prebiotic
effects in the human body. The use of β-galactosidase may present limitations due to its
characteristics, such as restriction in temperatures, pHs, and impossibility of reuse, among
others. Kluyveromyces lactis and Kluyveromyces marxianus are potential yeasts for obtaining
β-galactosidase and interfering in its characteristics. In order to circumvent these limitations in
the processes, enzyme immobilization methods are used. Covalent bonding is one of these
processes, it promotes resistance of immobilized enzymes under different conditions and
reduces leaching losses. Silica is a widely used support, as it promotes good enzyme binding to
the support. Therefore, the aim of the current work was to evaluate the immobilization of
commercial β-galactosidase from K. lactis and β-galactosidase produced by K. marxianus in
silica with controlled porosity and subsequently carry out the synthesis of
galactooligosaccharides. An evaluation of the best immobilization conditions for commercial
β-galactosidase was performed with a Central Composite Design (CCD). The immobilized
biocatalyst was characterized in relation to the influence of pH and temperature on enzyme
activity, thermal stability, pH and storage, reuse, Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR),
and scanning electron microscopy (SEM). The hydrolysis of lactose with the immobilized
enzyme was also evaluated in a fixed bed. The β-galactosidase produced by submerged
fermentation of K. marxianus was evaluated for immobilization on silica and for some partial
purification techniques. The synthesis of galactooligosaccharides was performed with the
commercial enzyme and produced in its free and immobilized form. The ionic strength of the
buffer was evaluated in the transgalactosylation and a Fractional Factorial Design was also
proposed to evaluate the interference of the initial lactose concentration, agitation, and
temperature in the synthesis of GOS. Magnetic and mechanical stirring and the fixed bed reactor
configuration were also evaluated in the synthesis of GOS. The best immobilization conditions
were at 1,0% γ-aminopropyltriethoxysilane (APTES) concentration, initial enzyme activity
offered at 21 U.mL-1, and 6,86% glutaraldehyde concentration. The immobilized biocatalyst
showed optimal pH at 7.0, the temperature at 30 °C, and stability at pH 7.5. Thermal stability
was better at a milder temperature of 20 °C. In 4 cycles of reuse, the enzyme maintained ≈70%
of the initial activity and stored (8 °C) maintained its activity in 44% after 105 days. The FTIR
allowed visualization of enzyme groups and supported enzyme binding. The images
obtained from SEM showed the structure of the silica. With the fixed bed, a lactose conversion
of ≈47% was obtained. The immobilization of the β-galactosidase produced with K. marxianus
was limited and among the partial purification techniques the dialysis process stood out. The
GOS were produced in high concentrations of lactose (400 g.L-1), with a shorter time (3 h) for
free enzyme and longer for immobilized enzyme (6 h). The effects of the variables evaluated in
the Fractional Factorial Design were positive, the most effective influence was agitation, the
highest concentration of GOS was 67.70 g.L-1. Both in magnetic and mechanical agitation it
was possible to synthesize the GOS with the immobilized enzyme, the GOS concentrations
were 70.81 and 90.37 g.L-1, respectively. In a fixed bed, the highest GOS concentrations were
obtained for the column packed with immobilized silica, reaching a value of 100.18 g.L-1. The
enzyme produced by K. marxianus synthesized GOS in its free form (106.97 g.L-1). Silica
immobilized β-galactosidase shows promise in both lactose hydrolysis and GOS synthesis.
Palavras-chave
β-galactosidase, sílica, ligação covalente, transgalactosilação, galactooligossacarídeos, silica, covalent bonding, transgalactosylation, galactooligosaccharides.
Citação
SOUSA, Carla Cristina de. Imobilização de β-galactosidase comercial e produzida por K. marxianus em sílica e avaliação da síntese enzimática de galacto-oligossacarídeos. 2022. 166 f. Tese (Doutorado em Engenharia Química) - Universidade Federal de Uberlândia, 2022. DOI http://doi.org/10.14393/ufu.te.2022.134