Publicação: Caracterização funcional e estrutural de novas proteases isoladas
da peçonha de Bothrops alternatus e do látex de Euphorbia milii var.
hislopii
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CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::GENETICA
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CAPÍTULO II: Uma serinoprotease da peçonha de Bothrops alternatus foi isolada por
meio de três etapas cromatográficas: DEAE Sephacel, Sephadex G-75 e
Benzamidina-Sepharose. A enzima purificada, denominada balternina, apresentou
uma única banda protéica quando analisada em SDS-PAGE, eletroforese em gel
de poliacrilamida sob condições desnaturantes, apresentando peso molecular de
aproximadamente 31.500 e 27.000 na presença e na ausência de agente redutor,
respectivamente. O cDNA completo foi obtido por RT-PCR e a proteína madura
de 236 resíduos de aminoácidos foi codificada por 708 pares de bases. O
alinhamento múltiplo das sequências de aminoácidos deduzidas desta enzima
mostrou similaridade estrutural com outras serinoproteases de peçonhas de
serpentes. A balternina apresentou atividades fibrinogenolítica e albuminolítica.
Quando a protease e o fibrinogênio bovino foram incubados a 37 °C, na
proporção de 1:10 (m/m), a enzima clivou preferencialmente a cadeia Aα e,
aparentemente, não degradou as cadeias Bβ e do substrato. Testes de
estabilidade mostraram que o intervalo ótimo de temperatura e pH para a
atividade proteolítica sobre o fibrinogênio foram de 30 a 40 °C e 7,0 a 8,0,
respectivamente. O efeito de inibidores enzimáticos mostrou que a benzamidina
inibiu a atividade fibrinogenolítica, indicando que a balternina é uma
serinoprotease. A enzima isolada causou, ainda, alterações morfológicas no
coração, fígado, pulmão e músculo de camundongos, desencadeando também
coagulação in vitro e desfibrinogenação in vivo, quando administrada
intraperitonealmente em camundongos, sugerindo ser uma enzima thrombin-like .
Desta forma, a balternina pode ser de interesse como agente terapêutico na
prevenção e tratamento de desordens trombóticas. CAPÍTULO III: A protease, designada de eumilina, foi isolada do látex de Euphorbia milii
var. hislopii pela combinação de duas etapas cromatográficas: troca iônica
(DEAE-Sephacel) e filtração em gel (Sephadex G-75). A eumilina é uma proteína
monomérica com massa molecular aparente de 30 kDa quando analisada em
SDS-PAGE sob condições redutoras e apresentou um pico principal de 29,814
kDa em espectrometria de massa MALDI-TOF/TOF. A eumilina apresentou
atividades caseinolítica e fibrinogenolítica, mas não desencadeou atividade
hemorrágica ou desfibrinogenante. Esta protease hidrolisa preferencialmente a
cadeia A do fibrinogênio e, mais lentamente, a cadeia B. A atividade
fibrinogenolítica foi inibida por b-mercaptoetanol e leupeptina. Em contraste, o
EDTA e a benzamidina não afetaram a referida atividade. A ação proteolítica da
eumilina sobre a caseína apresentou pH ótimo igual a 8,0 e foi estável em solução
até 40 °C; perdendo completamente a atividade em temperatura 80 °C. A
injeção Intraplantar de eumilina (1 25 μg/pata) causou hiperalgesia dose e tempodependente,
com pico entre 1 a 5 h após injeção de enzima. Da mesma forma,
causou resposta edematogênica máxima após 1 h. A análise morfológica indicou
que a eumilina induziu mionecrose intensa, com infiltrado leucocitário e danos em
células musculares cerca de 24 h após a injeção. CAPÍTULO IV: A balternina e a eumilina são proteases extraídas da peçonha da serpente
Bothrops alternatus e do látex de Euphorbia milii var. hislopii, respectivamente. As
estabilidades da balternina e da eumilina contra a desnaturação pelo calor e por
uréia foram determinadas e comparadas entre si. A protease vegetal mostrou-se
mais resistente quando aquecida em altas temperatutas e também quando
submetida à ação da uréia como desnaturante. Novos estudos serão importantes
para melhor caracterizar as condições necessárias para estabilização dessas
enzimas, especialmente aquelas relacionadas com as estratégias de proteção
relacionadas ao transporte e estocagem nos processos comercial, terapêutico e
biotecnológico.
Abstract
CHAPTER II: A protease, which we designate Eumiliin, was isolated from the latex of
Euphorbia milii var. hislopii by a combination of ion-exchange chromatography
using DEAE-Sephacel and gel filtration with Sephadex G-75. Eumiliin is a
monomeric protein with an apparent molecular mass of 30 kDa by SDS PAGE
under reducing conditions and gave one main peak at 29814 kDa in MALDITOF/
TOF mass spectrometry. Eumiliin has caseinolytic and fibrinogenolytic
activities, but no hemorrhagic or defibrinating activities. The enzyme readily
hydrolyzes the Aα-chain of fibrinogen and, more slowly, the Bß-chain. Its
fibrinogenolytic activity is inhibited by b-mercaptoethanol and leupeptin. In
contrast, EDTA and benzamidine did not affect the activity of Eumiliin. The
caseinolytic activity of Eumiliin had a pH optimum of 8.0 and was stable in solution
at up to 40 °C; activity was completely lost at 80 °C. Intraplantar injection of
Eumiliin (1 25 μg/paw) caused a dose- and time-dependent hyperalgesia, which
peaked 1 - 5 h after enzyme injection. Intraplantar injection of Eumiliin (1 25
μg/paw) also caused an oedematogenic response that was maximal after 1 h.
Morphological analyses indicated that Eumiliin induced an intense myonecrosis,
with visible leukocyte infiltrate and damaged muscle cells 24 h after injection. CHAPTER III: A protease, which we designate Eumiliin, was isolated from the latex of
Euphorbia milii var. hislopii by a combination of ion-exchange chromatography
using DEAE-Sephacel and gel filtration with Sephadex G-75. Eumiliin is a
monomeric protein with an apparent molecular mass of 30 kDa by SDS PAGE
under reducing conditions and gave one main peak at 29814 kDa in MALDITOF/
TOF mass spectrometry. Eumiliin has caseinolytic and fibrinogenolytic
activities, but no hemorrhagic or defibrinating activities. The enzyme readily
hydrolyzes the A-chain of fibrinogen and, more slowly, the B-chain. Its
fibrinogenolytic activity is inhibited by b-mercaptoethanol and leupeptin. In
contrast, EDTA and benzamidine did not affect the activity of Eumiliin. The
caseinolytic activity of Eumiliin had a pH optimum of 8.0 and was stable in solution
at up to 40 °C; activity was completely lost at 80 °C. Intraplantar injection of
Eumiliin (1 25 μg/paw) caused a dose- and time-dependent hyperalgesia, which
peaked 1 - 5 h after enzyme injection. Intraplantar injection of Eumiliin (1 25
μg/paw) also caused an oedematogenic response that was maximal after 1 h.
Morphological analyses indicated that Eumiliin induced an intense myonecrosis,
with visible leukocyte infiltrate and damaged muscle cells 24 h after injection. CHAPTER IV: Bhalternin and Eumiliin are proteases extracted from the venom of Bothrops
alternatus and latex of Euphorbia milli var. hislopii, respectively. The stabilities of
Bhalternin and Eumiliin against denaturation by heat and urea were determined
and compared. The plant protease proved to be tougher when heated at high
temperatures and also when subjected to the action of urea as denaturant. Further
studies are needed to better characterize the conditions for stabilization of these
enzymes, especially those related to the strategies needed to protect the transport
and storage in the commercial, therapeutic and biotechnological processes.
Palavras-chave
Cobra venenosa - Veneno, Bothrops, Bothrops alternatus, Peçonha de serpente, Fibrinogenase, Desfibrinogenação, Euphorbia milii, Crown-of-Thorns, Euphorbiaceae, Cysteine protease, Eumiliin
Citação
COSTA, Júnia de Oliveira. Caracterização funcional e estrutural de novas proteases isoladas
da peçonha de Bothrops alternatus e do látex de Euphorbia milii var.
hislopii. 2010. 144 f. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas) - Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 2010.