Publicação: Caracterização estrutural e funcional de metaloproteases isoladas de peçonhas botrópicas
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CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::GENETICA
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CAPÍTULO II: No presente trabalho demonstramos a caracterização bioquímica e
funcional da Botropoidina, uma metaloprotease hemorrágica isolada da peçonha
da serpente Bothrops pauloensis. Esta proteína foi purificada após três passos
cromatográficos: CM-Sepharose fast flow, HiTrep Sephacryl S-300 RP, HiTrep
Capto Q. Botropoidina mostrou-se homogênea em SDS-PAGE sob condições
redutoras e não redutoras e apresentou uma única cadeia polipeptídica de 49.558
Da por análises de MALDI-TOF. A proteína apresentou ponto isoelétrico de 3,76 e
a sequência de dois fragmentos obtidos por Peptide Mass Fingerprinting (PMF)
em MS (MALDI-TOF\\TOF) apresentou score significativo quando comparado com
outras SVMPs. Esta enzima apresentou atividade proteolítica sobre azocaseína,
as cadeias Aα e Bβ do fibrinogênio, fibrina, colágeno e fibronectina. A enzima foi
estável na faixa de pH de 6-9 e em baixas temperaturas quando ensaiada sobre
a azocaseína. Além disso, sua atividade foi inibida por EDTA, 1,10-fenantrolina e
β-mercaptoetanol. Esta enzima agiu sobre a coagulação sanguínea alterando os
tempos de tromboplastina parcial ativada (TTPa) e de protrombina (TP), além de
tornar o sangue de camundongos incoagulável. Botropoidina foi capaz de induzir
hemorragia (DMH= 0,98μg) e necrose no músculo gastrocnêmio de
camundongos, demonstrando uma alta toxicidade. Esta enzima também foi capaz
de inibir a agregação plaquetária induzida por colagéno e ADP e interferiu na
adesão e viabilidade de células endoteliais tEnd. Considerados em conjunto,
estes resultados nos levam a sugerir que Botropoidina é uma α-fibrinogenase
hemorrágica capaz de contribur significativamente para a toxicidade do
envenenamento por Bothrops pauloensis. CAPÍTULO III: Neste trabalho, uma metaloprotease não hemorrágica e fibrin(ogen)olitica
(BleucMP) foi purificada da peçonha da serpente de Bothrops leucurus em dois
passos cromatográficos: DEAE-Sephadex A-25 e CM-Sepharose Fast Flow.
BleucMP representa 1,75% (m/m) da peçonha bruta e mostrou-se hemogenea em
SDS-PAGE. A análise de BleucMP por MALDI TOF/TOF, reveleu uma massa
molecular de 23057,54Da e quando alquilada e reduzida sua massa é de
23830.40Da. A análise dos peptídeos gerados por MS (MALDI TOF/TOF) que
mostraram score significantes foi comparado com outras proteínas usando NCBIBLAST2
alignment display. Em relação à atividade proteolítica, BleucMP foi
eficiente sobre fibrinogênio, fibrina e azocaseína, e foi inibida por EDTA e 1,10-
fenantrolina. Esta enzima também foi capaz de diminuir significativamente os
níveis de fibrinogênio plasmático, tornando assim o sangue incoagulável. No
entanto foi desprovida de atividade hemorrágica quando testada na pele de
camundongos e não induziu relevantes alterações bioquímicas, hematológicas e
histopatológicas em camundongos. Os aspectos abordados neste trabalho
fornecem dados sobre o efeito da BleucMP no envenenamento de serpentes do
gênero Bothrops leucurus, a fim de melhor compreender a ação das
metaloproteases no envenenamento causado por serpentes.
Abstract
CHAPTER II:In the present work, we demonstrate the biochemical and functional
characterization of Bothropoidin, a hemorrhagic snake venom metalloproteinase
isolated from Bothrops pauloensis snake venom. This protein was purified after
three chromatographic steps on CM-Sepharose fast flow, HiTrep Sephacryl S-300
RP and HiTrep Capto Q. Bothropoidin was homogeneous by SDS-PAGE under
reducing and nonreducing conditions, and was shown to present a single chain of
49,558 Da by MALDI TOF analysis. The protein presented isoeletric point of 3.76
and the sequence of two fragments obtained by Peptide Mass Fingerprinting
(PMF) in MS (MALDI TOF\\TOF) showed significant score when compared with
another SVMPs.This enzyme showed proteolytic activity upon azocasein, Aα-
chain of fibrinogen, fibrin, collagen and fibronectin. The enzyme was stable at pH
between 6-9 and lower temperatures when assayed on azocasein. Moreover, this
activity was inhibited by EDTA, 1,10-phenanthroline and β-mercaptoethanol. This
enzyme acted on blood clotting altering the aPTT and PT. Bothropoidin was able
to induce hemorrhage (MHD=0.98 μg) and necrosis in the gastrocnenius muscles
of mice, showing high toxicity. The protein was capable of inhibiting platelet
aggregation induced by collagen and ADP and interfered with viability and cell
adhesion when incubated with tEnd endothelial cells in a dose dependent manner.
Taken together, these results lead us to suggest that Bothropoidin is a
hemorrhagic α-fibrinogenase which can contribute significantly to the toxicity of
Bothrops pauloensis envenomation. CHAPTER III: A fibrino(geno)lytic nonhemorrhagic metalloproteinase (BleucMP) was
purified from Bothrops leucurus snake venom by two chromatographic steps
procedure on DEAE-Sephadex A-25 followed by CM-Sepharose Fast Flow
column. BleucMP represented 1.75% (w/w) of the crude venom and was
homogeneous on SDS-PAGE. BleucMP analyzed by MALDI TOF/TOF, showed a
molecular mass of 23,057.54 Da and when alkylated and reduced, the mass is
23,830.40 Da. Their peptides analyzed in MS (MALDI TOF\\TOF) showed
significant score when compared with those of other proteins by NCBI-BLAST2
alignment display. As regards their proteolytic activities, BleucMP efficiently acted
on fibrinogen, fibrin, and was inhibited by EDTA and 1.10-phenanthroline. This
enzyme was also able to decrease significantly the plasma fibrinogen level
provoking blood incoagulability, however was devoid of hemorrhagic activity when
tested in the mice skin and did not induce relevant biochemical, hematological and
histopathological alterations in mice. The aspects addressed in this paper provide
data on the effect of BleucMP in envenomation from B. leucurus snakes in order to
better understand the effects caused by snake venom metalloproteinase.
Palavras-chave
Bothrops pauloensis, Metaloprotease hemorrágica, MS(espectrometria de massa), Células tEnd, Agregação plaquetaria, Bothrops leucurus, Veneno de serpente, Metaloprotease, Fibrin(ogen)olitica, Hemorrhagic metalloproteinase, MS(mass spectrometry), Platelet aggregation, TEnd cells, Snake venom, Metalloproteinase, Fibrin(ogen)olytic., Bioquímica, Serpente peçonhenta - Peçonha, Bothrops
Citação
GOMES, Mário Sérgio Rocha. Caracterização estrutural e funcional de metaloproteases isoladas de peçonhas botrópicas. 2013. 141 f. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas) - Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 2013. DOI https://doi.org/10.14393/ufu.te.2013.36 DOI https://doi.org/10.14393/ufu.te.2013.36