Publicação: Estudo da suscetibilidade de amastigotas extracelulares das
cepas G e CL de Trypanosoma cruzi a componentes do sistema
imune inato e adaptativo. Avaliação da atividade pró-fagocítica da
P21-His6
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CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::IMUNOLOGIA::IMUNOLOGIA APLICADA
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Coorientador
Ferro, Eloisa Amália Vieira
Resumo
Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da doença de Chagas. Devido à ampla
diversidade genética existente em T. cruzi, a espécie foi dividida em seis discretas
unidades de tipagem (DTU), denominadas T.cruzi I a VI. A cepa G pertence ao grupo
T.cruzi I e a CL a T.cruzi VI. Formas amastigotas extracelulares (AE) são consideradas
importantes na manutenção do ciclo no hospedeiro vertebrado. Estudos quanto à
diferença de infectividade e caracterização da suscetibilidade imunológica de parasitas
pertencentes aos diferentes grupos mostram-se relevantes para que terapias baseadas na
resposta imunológica sejam eficientes para todos os grupos filogeneticamente distintos.
A proteína P21 de T. cruzi foi recentemente caracterizada e sua possível atuação no
processo de internalização do parasito na célula hospedeira foi observada. Dar
continuidade à caracterização funcional da P21 de T. cruzi por meio do emprego de sua
forma recombinante (P21-His6) é de grande relevância, pois esta poderá futuramente
figurar entre os potenciais alvos terapêuticos para o tratamento da doença de Chagas. O
objetivo deste trabalho foi comparar a infecção in vitro e in vivo por amastigotas
extracelulares das cepas G e CL, bem como avaliar o potencial pró-fagocítico da P21-
His6. Para isto, foram realizadas experimentações in vitro e in vivo. Nos experimentos in
vitro foi observado maior infectividade e multiplicação de AE da cepa G do que de CL.
Contudo, AE da cepa G mostraram-se mais suscetíveis, tanto a atuação de macrófagos
inflamatórios, em experimentos ex vivo, quanto daqueles diferenciados e estimulados
com IFN-γ in vitro. Dentre os animais infectados com a cepa G, somente C. callosus
apresentou parasitemia sub-patente e os nocautes para IL-12 e IFN-γ apresentaram
parasitemia patente e alta mortalidade. Todos os animais infectados com a cepa CL
apresentaram parasitemia, contudo os nocautes para TNF-α, iNOS, Myd-88 e IL-12
apresentaram maior parasitemia e mortalidade em relação aos selvagens. Em
experimentos onde camundongos foram imunossuprimidos foi observada elevada
parasitemia para a cepa CL e para a G. Conclui-se, portanto, que AE da cepa G
provavelmente não apresentam parasitemia in vivo devido a sua maior suscetibilidade a
atuação de macrófagos ativados com IFN-γ. Para o estudo da proteína P21, realizaramse
ensaios de invasão e de fagocitose in vitro, no qual macrófagos peritoneais de C.
callosus foram infectados com AE de T. cruzi, promastigotas de Leishmania
amazonensis, taquizoitas de Toxoplasma gondii, ou ainda incubados com partículas de
zimozan, e foram tratados ou não com P21-His6. Também realizou-se
imunofluorescência de filamentos de actina em macrófagos tratados ou não com P21-
His6. Finalmente, realizou-se outra reação de imunofluorescência para marcação de
filamentos de actina em macrófagos que se submeteram ao tratamento de P21-His6, ao
tratamento com wortmanina, ou ambos. Os resultados demonstraram que P21-His6
aumentou a internalização de todos os parasitos e da partícula inerte. Além disso,
macrófagos tratados com a proteína apresentaram aumento na polimerização de actina
cortical. No entanto, o tratamento de wortmanina conjuntamente a P21-His6 inibiu sua
atuação na polimerização da actina celular. Conclui-se, portanto, que P21-His6 é capaz
de induzir processo fagocítico inespecificamente, sendo devido a atuação da proteína no
citoesqueleto de actina cortical, por um processo de sinalização provavelmente
dependente da ativação de PI3-quinase.
Abstract
Trypanosoma cruzi is the ethiologic agent of Human Chagas disease. Due to T.
cruzi wide genetic diversity, the species has been divided in six Discrete Typing Units
(DTU), named T. cruzi I to VI. The G strain belongs to T. cruzi I group and CL to T.
cruzi VI. Extracellular amastigotes forms (EA) are considered important in maintaining
the vertebrate host cycle. Studies concerning the difference of infectiveness and the
characterization of immunologic susceptibility in parasites belonging to different groups
are relevant so that therapies based upon immunological response may be efficient for
all distinct phylogenetic groups. T. cruzi´s P21 protein has recently been characterized
and its probable action in parasites internalization process into host cell was observed.
To give continuity to the functional characterization of T. cruzi´s P21 employing its
recombinant form (P21-His6) is of great relevance taking into account that these could
in the future take part into the potential therapeutic goals. This work intended to
compare the in vivo and in vitro infection of EA from G and CL strains, as well as to
assess P21-His6pro-phagocytic potential. So that experiments in vitro and in vivo have
been made. in vitro assays showed a greater infectiveness and multiplication of EA
from G strain than of CL. Nevertheless EA from G strain showed more susceptible as to
inflammatory macrophages action in ex vivo experiments as to those differenciated and
in vitro stimulated with IFN-γ. Among the G strain infected animals, only Calomys
callosus showed sub-patent parasitemia and the IL-12 and IFN-γ knockouts showed
patent parasitemia and high mortality. All the CL strain infected animals showed
parasitemia, but the TNF-α, iNOS, Myd-88 and IL-12 knockouts showed greater
parasitemia and mortality in comparision to the wild ones. In the assays of
immunossupressed mice, it has been observed high parasitemia for CL and G strains.
We, then conclude that EA from G strain probably don t show in vivo parasitemia due
to its greater susceptibility to IFN-γ activated macrophages. To study P21 protein it has
been made in vitro invasion and phagocytosis assayes in that C. callosus peritoneal
macrophages were infected with T. cruzi´s EA, Leishmania amazonensis promastigotes,
Toxoplasma gondii taquizoitas or otherwise invadid with zymozan particle, and then
treated or not with P21-His6. It has also been made immunofluorescence of actin
filaments in macrophages treated or not with P21-His6. Finaly, another
immunofluorescence reaction was made in order to mark actin filaments in macrophage
submitted to P21-His6, to wortmanin treatment, or both. Results showed that P21-His6
hightened all parasites and the inactive particle internalization. Besides macrophages
treated with the protein showed increase in cortical actin polymerization. Nevertheless,
the treatment with wortmanin together with P21-His6 inhibited its action in actin
cellular polymerization. We conclude that P21-His6 is capable of inducing inespecific
phagocytic process probably to its action into the cortical actin cytoskeletal, by means
of signalization process probably depending on PI3-kinase activation.
Palavras-chave
Trypanosoma cruzi, IFN-γ, P21, Fagocitose, Citoesqueleto de actina, PI3-quinase, Immune response, Phagocytosis, Actin cytoskeleton, PI3-Kinase, Chagas, Doença de, Resposta imune
Citação
RODRIGUES, Adele Aud. Estudo da suscetibilidade de amastigotas extracelulares das
cepas G e CL de Trypanosoma cruzi a componentes do sistema
imune inato e adaptativo. Avaliação da atividade pró-fagocítica da
P21-His6. 2011. 113 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas) - Universidade Federal de Uberlândia, Uberlandia, 2011.