Publicação: Efeito do óxido nítrico sobre a atividade e expressão da ntpdase1 e da ecto-5'-nucleotidase em linhagens de células vasculares
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CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::BIOQUIMICA::BIOLOGIA MOLECULAR
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Resumo
Compreender os mecanismos que atuam na vasculatura representa um caminho promissor
para o desenvolvimento e entendimento de novos estudos para as desordens vasculares.
Os nucleotídeos extracelulares (ATP, ADP) e o nucleosídeo adenosina modulam o
vasorelaxamento e a vasoconstrição, e estão envolvidos na produção do vasodilatador
óxido nítrico (NO). Permanece por ser investigado se o NO é capaz de modular as
ectonucleotidases, enzimas que hidrolisam os nucleotídeos, controlado sua
disponibilidade no meio extracelular. As NTPDases 1 e 2 hidrolisam ATP e ADP; e a
ecto-5’-nucleotidase metaboliza AMP até adenosina, também um vasodilatador. Para
determinar o efeito do NO sobre as ectonucleotidases vasculares, células musculares lisas
vasculares A7r5 e células endoteliais tEnd.1 foram tratadas com agente doador de NO
(nitroprussiato de sódio (SNP)), inibidor da síntese de NO (L-NAME) e mobilizadores de
NO (ATP, ADP, bradicinina (BK) e 2-Cl-adenosina). Após 24 horas, através do ensaio
de MTT, notou-se uma diminuição de 35% na viabilidade das células A7r5 tratadas com
2-Cl-adenosina (10-4M). Os níveis de nitrito, dosados pelo reagente de Griess,
aumentaram nos dois tipos celulares em resposta ao SNP, indicando um aumento indireto
dos níveis de NO. As atividades enzimáticas foram detectadas colorimetricamente pelo
fosfato inorgânico liberado. As hidrólises de ATP e ADP não foram alteradas. Entretanto,
a hidrólise de AMP foi significativamente aumentada pelo ATP e 2-Cl-adenosina em
A7r5; e pelo ATP e ADP em tEnd.1. O aumento na atividade da ecto-5’-nucleotidase
parece ser importante para aumentar os níveis de adenosina circulante, já que ela é
fundamental para garantir a regulação da homeostase e a manutenção do tônus vascular.
A tentativa de avaliação da expressão gênica das ectonucleotidases em resposta aos
tratamentos em células A7r5 não foi bem-sucedida. Ainda, não foram encontradas
alterações em nível proteico, avaliado por Western blotting. Porém, o aumento na
atividade da enzima poderia ser explicado pela presença de sítios específicos altamente
fosforiláveis em sua estrutura, principalmente em resíduos de serina. Embora os
resultados obtidos nos levem a crer que as ectonucleotidases sejam moduladas
independentemente do NO em A7r5, experimentos adicionais são necessários para
confirmar a concentração de NO no meio de cultivo de tais células e os níveis de regulação
sofridos pelas enzimas em questão. A compreensão de tais funções e mecanismos de ação
do NO e outras moléculas vasoativas sobre as ectonucleotidases vasculares são
fundamentais para a compreensão das desordens vasculares.
Abstract
Understanding the mechanisms that act in the vasculature represent a promising path for
the development and understanding of future studies about vascular disorders. It is known
that extracellular nucleotides (ATP, ADP) and nucleoside adenosine are able to modulate
vasorelaxation and vasoconstriction and are involved in the production of the vasodilator
nitric oxide (NO). It remains to be investigated whether NO is able to modulate the
expression and activity of ectonucleotidases, enzymes that hydrolyze nucleotides
controlling their availability in the extracellular environment. NTPDases 1 and 2
hydrolyze ATP and ADP and ecto-5'-nucleotidase metabolizes AMP to adenosine, also a
vasodilator. To determine the effect of NO on vascular ectonucleotidases, vascular
smooth muscle cells A7r5 and endothelial cells tEnd.1 were treated with NO donor
(sodium nitroprusside (SNP)), inhibitor of NO synthesis (L-NAME) and mobilizers of NO
(ATP, ADP, bradykinin (BK) and 2-Cl-adenosine). After 24 hours, a 35% decrease in cell
viability of A7r5 cells was observed by MTT assay in response to 2-Cl-adenosine (10-4M).
Nitrite levels, measured by Griess's reagent, significantly increased in the two cell types
treated with SNP, indicating an indirect increase in NO levels. The enzymatic activities
were detected colorimetrically by the inorganic phosphate released. The hydrolysis of
ATP and ADP was not altered. However, AMP hydrolysis was significantly increased by
ATP and 2-Cl-adenosine in A7r5 cells and by ATP and ADP in tEnd.1 cells. The increase
in ecto-5'-nucleotidase activity seems to be important to increase levels of circulating
adenosine, since it is of great importance to ensure regulation of homeostasis and
maintenance of vascular tone. The attempt to evaluate the gene expression of
ectonucleotidases in response to treatments in A7r5 cells was not successful. Besides, no
changes were found in protein level, as assessed by Western blotting. However, the
increase in enzyme activity could be explained by the presence of specific highly
phosphorylable sites, especially in serine residues, in the structure of the ecto-5'-
nucleotidase. Although the results obtained lead us to believe that the ectonucleotidases
are modulated independently of the NO in A7r5, additional experiments are required to
confirm the concentration of NO in the culture medium of such cells and the levels of
regulation undergone by the enzymes in question. The understanding of the functions and
mechanisms of action of NO and other vasoactive molecules on vascular
ectonucleotidases are of fundamental relevance for the understanding of vascular
disorders.
Palavras-chave
Biotecnologia, Purinérgicos, Óxido nítrico, Vasculatura, Biotechnology, Purinergics, Nitric oxide, Vasculature
Citação
ARAÚJO, Bruna Juber de. Efeito do óxido nítrico sobre a atividade e expressão da ntpdase1 e da ecto-5'-nucleotidase em linhagens de células vasculares. 2019. 76f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Universidade Federal de Uberlândia, Patos de Minas, 2019. DOI http://dx.doi.org/10.14393/ufu.di.2019.341