Publicação: Identificação e caracterização de biomarcadores teciduais e sorológicos no câncer de mama por Phage Display
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CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::GENETICA
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Coorientador
Goulart Filho, Luiz Ricardo
Resumo
CAPITULO II: O câncer de mama é uma das principais causas de morte em mulheres e
ainda não existem medidas específicas de prevenção primária. A detecção
precoce é o objetivo principal, visando à diminuição da mortalidade e aumento da
sobrevida. Nesse trabalho foi utilizada a técnica de Phage Display para isolar
peptídeos ligantes às proteínas do tecido câncer de mama para obtenção de
biomarcadores que possam ser utilizados no diagnóstico e tratamento dessa
patologia. Para seleção desses peptídeos foi realizado um Bioppaning subtrativo,
no qual duas bibliotecas de peptídeos Ph.D.-7 e Ph.D.-12 expressas na
superfície de fago filamentoso M13 foram colocadas primeiramente em contato
com proteínas de tecido de mama normal, para que os fagos ligantes a proteínas
do tecido normal fossem eliminados nessa etapa, e depois foram submetidas a
três ciclos de seleção. O DNA dos fagos selecionados foi seqüenciado e
traduzido. As seqüências peptídicas selecionadas foram analisadas por
bioinformática e pelas técnicas ELISA, dot-blotting, wertern-blotting e
imunohistoquímica para confirmar o sucesso da estratégia de seleção e para
fornecer novos subsídios quanto aos prováveis alvos biológicos. A análise
imunohistoquímica foi realizada com seis dos fagos selecionados (BC04, BC05,
BC07, BC11, BC12, BC17) em câncer de mama e com a mistura de três deles
(BC11, BC12, BC17), em câncer de mama, câncer de ovário, linfoma não-hodgkin
e melanoma. Todos os fagos selecionados apresentaram alto grau de informação
e Razão do Indice ELISA acima de 1, o que é considerado significativo. Tanto em
Dot-blotting quanto em wertern-blotting, os fagos se ligaram apenas a proteínas
do tumor. Na imunohistoquímica pode-se observar marcação apenas de células
tumorais. A mistura de fagos reconheceu proteínas do câncer de mama, câncer
de ovário e linfoma maligno não-Hodgkin e não reconheceu proteínas do
melanoma. Três fagos selecionados, BC04, BC05 e BC07 marcaram
especificamente a parede vascular de células tumorais. Os fagos selecionados
nesse trabalho podem, em um futuro próximo, ser utilizados como biomarcadores
teciduais, podendo ajudar tanto no diagnóstico, quanto no tratamento do câncer
de mama. O elevado grau de informação de cada peptídeo selecionado obtido
pelas análises de bioinformática e os resultados obtidos nos testes ELISA, Dotblotting,
Western-blotting e imunohistoquímica validam os dados de bioppaning
subtrativo e comprovam a eficiência da técnica de Phage Display. CAPITULO III: No Brasil, o câncer de mama é a patologia maligna mais frequente na
população feminina e tem o seu quadro agravado pelo fato do diagnóstico ser
estabelecido, na maioria das vezes, em fase tardia da doença. Nesse trabalho foi
utilizada a técnica de Phage Display para isolar peptídeos ligantes às proteínas do
soro de mulheres com câncer de mama para obtenção de biomarcadores que
possam ser utilizados no diagnóstico sorológico dessa patologia. Para seleção
dos peptídeos foi realizado um bioppaning subtrativo utilizando uma biblioteca de
peptídeos Ph.D.-12 expressa na superfície do fago filamentoso M13. A biblioteca
de fagos foi colocada, primeiramente, em contato com soro de mulheres
clinicamente sadias, depois em contato com soro de mulheres com doenças
benignas de mama, e por último, em contato com soro de mulheres com câncer
de mama, para que os fagos ligantes a proteínas do soro de mulheres sem a
patologia ou com doença benigna fossem eliminados. O DNA dos fagos
selecionados foi seqüenciado e as seqüências analisadas por bioinformática. As
técnicas ELISA e dot-blotting foram utilizadas para confirmar o sucesso da
seleção. Todos os clones analisados apresentaram Razão do Índice ELISA maior
do que um e alto grau de informação. A seqüência IETYESTHQSPP foi a mais
frequente e apresentou alta reatividade nas análises de dot-blotting com IgGs do
soro de pacientes com câncer de mama. Os clones T03, T18 e T09 apresentaram
similaridade com a Ubiquitina e os clones T06, T19, T04, T10, T11, T14, T17 com
motivos Zinc Finger. O fato de diferentes clones apresentarem similaridade para
um mesmo tipo de proteína sugere que diferentes motivos de uma mesma
proteína podem ser epítopos reconhecidos por autoanticorpos ou que esses
motivos estejam interagindo com proteínas associadas ao câncer de mama, visto
que o bioppaning foi feito com soro total.
Abstract
CHAPTER II: Breast cancer is one of the main causes of death among women, as there
is no primary prevention. Early detection is the main objective aiming decrease
mortality and increase survival. We used phage display technology to isolate
ligand peptides to breast cancer tissues in order to select potential biomarkers for
the improvement of diagnosis and treatment. Two random peptide libraries with
seven and twelve residues expressed in fusion with the pIII protein of the M13
bacteriophage, Ph.D.-7 and Ph.D.-12, respectively, were firstly submitted to a pre
clearing by placing them in contact with proteins of normal breast tissues, in oder
to eliminate peptides that may recognize healthy tissues. Remaining phages in the
supernatant was further selected through three rounds of positive selection. DNA
of selected phage were sequenced and translated. Peptide sequences were then
submitted to bioinformatic analyzes, ELISA, Dot-blotting, western-blotting and
immunohistochemistry assays to confirm the selection strategy and to provide
further evidences of the putative biological targets. The immunohistochemistry
analysis was performed with six selected phage (BC04, BC05, BC07, BC11,
BC12, BC17) in breast cancer, and a mixture of three phage (BC11, BC12, BC17)
has been tested in breast and ovary cancers, non-Hodgkin lymphoma, and
melanoma. All phages presented high information content with significant ELISA
indexes. The Dot-blotting and western-blotting assays have validated the selection
by demonstrating high specificity to tumor proteins. The immunohistochemistry
analyzes have shown specific binding only to tumor cells. The mixture of phages
has recognized all types of tumor tissues, except melanoma. Three selected
phage, BC04, BC05 and BC07 have specifically marked the vascular walls of
tumor cells. The selected phage may be used in the future as tissue biomarkers
for diagnosis and therapeutic procedures in breast cancer. The high information
content and the significant data presented by all immunological assays have
validated the Phage Display subtractive selection strategy. CHAPTER III: Breast cancer is the most frequent malignant pathology in the Brazilian
women population, which is aggravated by diagnosis in later stages of the
disease. The aim of this investigation was to select and identify ligand peptides to
serum proteins of women with breast cancer through phage display in order to use
them as serological biomarkers. Selection of phages was performed in three steps
using a random peptide library of 12 residues (Ph.D.-12). The first two selection
steps consisted of a pre clearing using the phage libraries against sera proteins of
healthy individuals, followed by a second selection against sera proteins of
patients with benign breast diseases. After subtraction, the library was submitted
to a positive selection against sera of patients with breast cancer. Phage ligands
were selected, amplified, and the DNA was sequenced and translated. Peptide
sequences were subimtted bioinformatic analyses and to ELISA and dot-blotting
assays to confirm selection success. All clones presented significant ELISA
indexes and a high information content. The sequence IETYESTHQSPP was the
most frequent and presented a high reactivity against IgG from breast cancer
patients´ in the dot-blotting analysis. Clones T03, T18 and T09 presented similarity
with the ubiquitin and clones T06, T19, T04, T10, T11, T14, T17 with zinc finger
motifs. The fact of different clones to present similarity for the same type of protein
suggests that different motifs of one same protein can be epitopes recognized by
auto-antibodies or that these motifs are interacting with proteins associated to
breast cancer, since biopanning was made with total serum.
Palavras-chave
Câncer de mama, Breast cancer, Mama - Câncer, Phage Display
Citação
SOUSA, Cristina Soares de. Identificação e caracterização de biomarcadores teciduais e sorológicos no câncer de mama por Phage Display. 2007. 111 f. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas) - Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 2007.