Publicação: Relações filogenéticas de Toxocara spp. e Toxascaris sp. provenientes de diferentes regiões do mundo
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CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::GENETICA
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Nejsum, Peter
Resumo
Os nematódeos dos gêneros Toxocara e Toxascaris são identificados, tradicionalmente, com
base nos aspectos morfológicos, entretanto a diversidade genética entre esses parasitos é
reconhecida, sendo a análise precisa dessa variação é necessária para o entendimento da biologia
desses organismos. Esse trabalho teve como objetivos estabelecer relações filogenéticas e
filogeográficas entre espécimes de Toxocara canis, Toxocara cati, Toxocara malaysiensis e
Toxascaris leonina, e comparar os resultados das técnicas morfológica e moleculares. Foram
coletados 436 helmintos adultos e quatro “pools” de ovos de canídeos e felídeos, procedentes de
oito países. Os parasitos foram analisados por microscopia estereoscópica, pela Reação em
Cadeia da Polimerase (PCR) e “Restriction Fragment Lenght Polymorfism” (PCR-RFLP). Os
primers TOXCOIF3 e TOXCOIF2 foram desenhados para amplificar 490 pares de base do gene
mitocrondrial Cox1 e a PCR-RFLP foi realizada utilizando-se a enzima MseI. As relações
filogenéticas entre os isolados foram observados no filograma e pelo cálculo das taxas de
variabilidade genotípicas (distância filogenética). Dos 313 parasitos adultos provenientes de
cães, 309 foram identificados, por microscopia, como T.canis e quatro como T. leonina. Dos 123
oriundos de gatos, 118 foram identificados como T. cati, quatro T. malaysiensis e um T. leonina.
Dentre os “pools” de ovos, os três de leoas foram identificados como T. leonina e o de cão como
T. canis. A PCR em todas as amostras analisadas (n=440) apresentou falha de 3,6%. Das
amostras amplificadas (n=424) 72 foram selecionadas para o sequenciamento. Com exceção de
três amostras, duas provenientes de gato foram caracterizadas como T. canis, e uma proveniente
de cão como T. cati, todas as restantes foram caracterizadas em concordância com os respectivos
hospedeiros. Das 424 amostras submetidas a PCR-RFLP, 351 foram identificadas como T.
canis/T.leonina, 70 como T. cati e três como T. malaysiensis. Essa técnica apresentou resultados
semelhantes ao sequenciamento. Foram observadas homologia e variação genotípica nas
espécies, sendo a maior 6,6%. Relações filogeográficas, dentro das espécies, puderam ser
observadas pelo filograma. Entre as técnicas, observou-se 9,7% de incongruência de resultados
entre microscopia e sequenciamento e 0,9% entre microscopia e PCR-RFLP. Entre as técnicas
moleculares, considerou-se somente T. cati e T. malaysiensis, o que significou 100% de
concordância entre resultados. A partir dos achados desse trabalho, conclui-se que alguns
isolados, da mesma espécie, apresentaram variabilidade intragenotípica; Sequências homólogas
foram identificadas em diferentes países, sugerindo a ocorrência de fluxo gênico; A procedência
geográfica teve relação direta com a variação genética dos parasitos; T. canis e T. cati
apresentaram taxa de variabilidade semelhante às de T. cati e T. leonina; E as três técnicas
utilizadas apresentaram resultados que indicam a preferência de T. canis, T. cati e T.
malaysiensis por determinados hospedeiros.
Abstract
The nematodes of the genus Toxocara and Toxascaris are identified, traditionally, based on the
morphologic aspects, however the genetic diversity among these parasites is recognized, being
an accurate analysis of this variation necessary for the understanding of the biology of these
organisms. This work aimed to establish the phylogenetic and phylogeographic relationships
among specimens of Toxocara canis, Toxocara cati, Toxocara malaysiensis and Toxascaris
leonina and to compare the results given by the morphologic and molecular techniques. In total,
436 helminths adults and four pools of eggs were collected from canids and felines from eight
countries. The parasites were analyzed by stereoscopic microscopy, by Polymerase Chain
Reaction (PCR) and by Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP). Primers
TOXCOIF3 and TOXCOIR2 were designed in order to amplify 90pb of the mitochondrial gene
Cox1, and the PCR-RFLP using the enzyme MseI could discriminate between these four species.
The phylogenetic relationships among the isolates were observed in the phylogram and by the
genetic variability (phylogenetic distance) rates. Of the 313 parasites adults, from dogs, 309 were
identified, by microscopy, as T. canis and four as T. leonina. Of 123 originating from cats 118
were identified as T. cati, four as T. malaysiensis and one as T. leonina. Among the pools the
three from lions were identified as T. leonina and that of dog as T. canis. PCR in all analyzed
samples (n=440) failed in 3,6%. Of the amplified samples (n=424) 72 were selected to
sequencing. With the exception of three samples, two from cats, were characterized as T. canis
and one from dog as T. cati, all remaining were identified in agreement with their respective
hosts. Of the 424 samples submitted to PCR-RFLP 351 were identified as T. canis/T.leonina, 70
as T. cati and three as T. malaysiensis. This technique presented similar results to sequencing.
Homology and genotypic variation were observed within species, being the largest one 6.6%.
Phylogeographic relationships within species could be observed by the phylogram. Among the
techniques it was observed 9,7% of incongruence in the results between microscopy and
sequencing, and 0,9% between microscopy and PCR-RFLP. Between the molecular techniques,
it was considered only T. cati and T. malaysiensis which meant 100% of agreement. Based on
the findings, of this study, it was concluded that some isolates of the same specie presented
intragenotipic variability; Homologous sequences were identified in different countries,
suggesting the occurrence of gene flow; The geographic origin was directed related to the
genetic variation of the parasites; T. canis and T. cati presented variability rates similar to T. cati
and T. leonina; And the three techniques used, herein, showed results that indicate a preference
of T. canis, T. cati and T. malaysiensis for certain hosts.
Palavras-chave
Imunologia, Nematódeos, Microscopia técnica, Toxocara spp, Toxascaris, Relações filogenéticas, Filogeografia, Especificidade de hospedeiro, Microscopia e técnicas morfológicas, Phylogenetic relationships, Host specificity, Molecular techniques
Citação
FAVA, Natalia de Melo Nasser. Relações filogenéticas de Toxocara spp. e Toxascaris sp. provenientes de diferentes regiões do mundo.Tese (Doutorado em Imunologia e Parasitologia Aplicadas) - Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 2017. DOI http://doi.org/10.14393/ufu.te.2017.163