Publicação: Identificação e caracterização funcional de novas proteínas de grânulos densos de Neospora caninum
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CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::IMUNOLOGIA::IMUNOLOGIA APLICADA, CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::PARASITOLOGIA::PROTOZOOLOGIA DE PARASITOS::PROTOZOOLOGIA PARASITARIA ANIMAL, CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::GENETICA::GENETICA MOLECULAR E DE MICROORGANISMOS
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Resumo
Neospora caninum é um protozoário que pertence ao filo Apicomplexa, possuindo uma
distribuição global sendo o agente etiológico da neosporose. Parasita s do filo Apicomplexa,
requerem a formação de um vacúolo parasitóforo ( para a replicação e a man utenção da
infecção dentro do hospedeiro. A formação do VP depende de uma maquinaria de secreção
de proteínas coordenada a partir de organelas como as micronemas, Roptrias e Grânulos
Densos. As proteínas de grânulos densos (GRAs), são proteínas essenciais para o
mantenimento da estrutura do VP , já que regula a estrutura, aquisição de n utrientes e são
capazes de regular a expressão g ê nica e o ciclo celular do hospedeiro. Pouco se sabe sobre
as GRAs de N. caninum , por tal motivo, no presente trabalho, objetivou se investigar sobre
a diversidade e o papel das GRAs de N. caninum para conhecer e elucidar suas funções
biológicas e seu papel na interação parasita hospedeiro. Utilizando abordagens in s i lico , foi
determinada a diversidade destas proteínas através de an á lises comparativas com o
organismo modelo T. gondii . Posteriormente, a estratégia de BioID foi empregada para
confirmar as GRAs preditas. Com a finalidade de melhor entender o papel biológico de
algumas GRAs, utilizando a tecnologia CRISPR/Cas9, cinco proteínas foram estudadas, por
m eio de marcação endógena e ablação g ê nica. Finalmente, os parasitas geneticamente
deficientes para as GRAs alvo foram utilizados para estudar o papel na replicação parasit á ria,
modulação da virulência e a resposta imune do hospedeiro. Um total de 145 GRAs foram
identificadas a partir da ortologia com T. gondi i , das quais, 81 foram identificadas no ensaio
de BioID, confirmando assim a presença dessas GRAs em N. caninum . Foram selecionadas
as proteínas GRA48, GRA62, GRA83, NSG1 e a proteína hipotética NCLIV_001830, como
alvo para as posteriores analises. Assim, todas as proteínas foram localizadas no VP. Foi
demonstrado que a GRA48, GRA62, GRA83, e NCLIV_001830 estão env olvidas na
replicação parasitaria. A NCLIV_001830 foi identificada como uma GRA que transloca ao
núcleo e junto com a GRA62 são capa zes de regular a expressão gênica de Nos2 e Nox2 . Em
BMDMs exceptuando a GRA48, as GRAs foram capazes de regular a liberação de IL12. Em
modelos murinos, foi confirmado que as GRAs selecionadas regulam a virulência do parasita
e estão relacionadas com a morbidade da doença. Conclui se que as GRAs de N. caninum
são um grupo de proteínas essenciais para a biologia parasitaria, sendo essenciais para os
processos de replicação do parasita, virulência nos hospedeiros e regulação da resposta
imune, assim, o conhe cimento e pesquisas futuras sobre estas proteínas é indispensável para
compreender a biologia do parasita e sua relação com o hospedeiro, sendo pontos de partida
para pesquisas que permitam desenvolver estratégias de prevenção e profilaxia da
neosporose.
Abstract
Neospora caninum is a protozoan that belongs to the Apicomplexa phylum , with a global
distribution and serving as the etiological agent of neosporosis. Apicomplexan parasites
require the formation of a parasita phorous vacuole (PV) for replication and maintenance of
infection within the host. The formation of the PV depends on a coordinated protein secretion
machinery from organelles such as micronemes, rhoptries, and dense granules. Dense granule
proteins (GRAs) are essential for maintaining the structure of the PV, as they regulate its
architecture, nutrient acquisition, and can modulate host gene expression and cell cycle. Little
is known about the GRAs of N. caninum , which is why this study aimed to investigate the
diversity and role of N. caninum GRAs to elucidate their biological functions and their role
in parasite host interactions. Using in silico approaches, the diversity of these proteins was
determined through comparative analyses with the model organism T. gondii . Subsequently,
the BioID strategy was employed to confirm the predicted GRAs. To better understand the
b iological role of specific GRAs, five proteins were studied using CRISPR/Cas9 technology,
through endogenous tagging and gene knockout. Finally, genetically modified parasites
deficient in the target GRAs were used to study their roles in parasitic replica tion, virulence
modulation, and host immune response. A total of 145 GRAs were identified based on
orthology with T. gondii , of which 81 were confirmed by BioID, validating their presence in
N. caninum . The proteins GRA48, GRA62, GRA83, NSG1, and the hypot hetical protein
NCLIV_001830 were selected for further analysis. All these proteins were localized in the
PV. It was demonstrated that GRA48, GRA62, GRA83, and NCLIV_001830 are involved in
parasitic replication. NCLIV_001830 was identified as a GRA that tr anslocates to the nucleus
and, along with GRA62, is capable of regulating the expression of Nos2 and Nox2 . In
BMDMs, except for GRA48, the GRAs were able to regulate the release of IL 12. In murine
models, it was confirmed that the selected GRAs regulate p arasite virulence and are related
to disease morbidity. It is concluded that N. caninum GRAs are a group of proteins essential
for parasitic biology, crucial for parasite replication, host virulence, and immune response
regulation. Therefore, understanding and further research on these proteins are essential for
comprehending the parasite's biology and its relationship with the host, providing a
foundation for developing prevention and prophylactic strategies for neosporosis.
Palavras-chave
Grânulos Densos, Vacúolo Parasitóforo, Neosporose, CRISPR/Cas9
Citação
TORRES, Jhoan David Aguillon. Identificação e caracterização funcional de novas proteínas de grânulos densos de Neospora caninum. 2024. 115 f. Tese (Doutorado em Imunologia e Parasitologia Aplicadas) - Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 2024. DOI http://doi.org/10.14393/ufu.te.2024.616