Publicação: Preparo, caracterização e eficácia in vitro de formulações lipossomais de circulação prolongada contendo Miltefosina e Antimonato de Meglumina para o tratamento da Leishmaniose Visceral
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CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::PARASITOLOGIA
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Resumo
A leishmaniose visceral (LV) é uma doença que representa um grave problema de saúde pública. A terapia com as drogas disponíveis demanda longo tempo de tratamento e apresentam diversos efeitos colaterais. Novas abordagens para o tratamento da LV têm sido sugeridas, como as baseadas em drogas leishmanicidas em formulações de lipossomas de circulação prolongada, a fim de aumentar sua eficácia terapêutica e reduzir os efeitos secundários. O objetivo deste estudo foi preparar, caracterizar e avaliar a eficácia, in vitro, de formulações lipossomais de ação prolongada contendo miltefosina e antimoniato de meglumina (AM) para o tratamento da LV. Os lipossomas peguilados contendo miltefosina (HePC-PEG) e os contendo miltefosina e antimoniato de meglumina (HePC-PEG/AM) foram preparados a partir da incorporação de polímero DSPE-PEG 2000 na membrana das vesículas, pelo método de "desidratação e reidratação de vesícula". A eficácia das formulações peguiladas foicomparada com o AM encapsulado lipossomas convencionais (LAM), lipossomas “vazios” (Lemp), AM e miltefosina livres. A caracterização (diâmetro hidrodinâmico, índice de polidispersão (IP) e potencial zeta (Z)) das formulações foi determinada por espectroscopia de correlação de fotóns, a taxa de encapsulação de Sb por espectroscopia de absorção atômica com forno de grafite, e sua presença nas formulações foi confirmada por cromatografia em camada delgada (CCD). Os ensaios de citotoxicidade (CC50) e atividade leishmanicida das formulações (CI50) foram realizados em macrófagos murinos utilizando o método colorimétrico MTT, e em formas promastigotas de Leishmania infantum utilizando o método colorimétrico de redução da resazurina, respectivamente. Foi avaliada, ainda, a eficácia das formulações contra amastigotas intracelulares 24h, 48h, e 72h após o tratamento. HePC-PEG e HePC-PEG/AM tiveram diâmetro hidrodinâmico inferiores a 200nm, IP˂0,3 e z˂-30mV. A análise por CCD sugeriu a presença da miltefosina nas formulações. HePC-PEG apresentou CC50 igual a 92,49 μg/mL e HePC-PEG/AM igual a 103,09μg/mL, ambas taxas maiores que a miltefosina livre (41,59μg/mL), sugerindo menor toxicidade celular da droga em formulação lipossomal. O valor de CI50 para HePC-PEG foi igual a 33,19µg/mL e 33,05 µg/mL para HePC-PEG/AM, enquanto para miltefosina livre o IC50 teve o valor de 49,59 µg/mL, sugerindo que a atividade leishmanicida da miltefosina nas formulações peguiladas manteve-se. Nos ensaios contra amastigotas intracelulares, as formulações peguiladas reduziram significativamente as taxas de infecção dos macrófagos em relação a AM, LAM, e Lemp, 72h após o tratamento, e em relação ao controle sem infecção, em todos os tempos avaliados. Em conclusão, as formulações HePC-PEG e HePC-PEG/AM apresentaram características de tamanho reduzido das vesículas, estabilidade elétrica, monodispersão, e significativa na redução das taxas de infecção de Leishmania infantum, in vitro.
Abstract
Visceral leishmaniasis (VL) is a disease that constitutes a serious public health problem. The
therapy with the available drugs demands long treatment time and causes many side effects.
New pharmacological approaches in the LV treatment have been suggested, such as those
based on leishmanicidal drugs with liposomal formulations of prolonged circulation (stealth
or PEGylated) seeking to increase therapeutic efficacy and reducing side effects. Therefore,
the aim of this study was to prepare, characterize and evaluate, in vitro, the efficacy of
PEGylated liposomal formulations containing miltefosine (HePC-PEG) and meglumine
antimoniate (MA) (HePC-PEG/AM) for the LV treatment. PEGylated liposomes HePC-PEG
and HePC-PEG/AM were prepared by the incorporation of the DSPE-PEG 2000 polymer in
the vesicle membranes, using the DRV method. Effectiveness of the PEGylated formulations
was compared with the conventional MA encapsulated-liposome (LAM), "empty" liposomes
(Lemp), MA and “free” miltefosine. The characterization of the PEGylated formulations
(hydrodynamic diameter, polydispersity index (PI) and zeta potential (Z)) were determined by
photon correlation spectroscopy, the Sb encapsulation rate by graphite furnace atomic
absorption spectrometry, and the presence of miltefosine in the formulations was determined
by thin layer chromatography (TLC). The cytotoxicity concentration (CC50) and inhibitory
concentration (CI50) assays of the formulations were evaluated in murine macrophages by
MTT colorimetric method and in promastigote forms of Leishmania infantum by resazurin
reduction colorimetric method, respectively. Also, the effectiveness of the formulations
against intracellular amastigotes 24h, 48h and 72h after treatment was evaluated. The
hydrodynamic diameter of the HePC-PEG and HePC-PEG/AM formulations were lower than
200nm, and PI˂0,3 e z˂-30mV. TLC analysis suggested the presence of miltefosine in the
formulations. CC50 of HepC-PEG was 92,49 µg/mL and for HePC-PEG/MA was
103,09µg/mL, both higher rates than miltefosine in its free form (41,59µg/mL), suggesting
less cell toxicity of the drug in liposomal formulation. The CI50 values were 33,19 µg/mL for
HepC-PEG and 33,05 µg/mL for HePC-PEG/MA, whereas the free miltefosine IC50 was
49,59 µg/mL, suggesting that the leishmanicidal activity of miltefosine in PEGylated
formulations remained. In the tests with intracellular amastigotes, the PEGylated formulations
significantly reduced macrophage infection rates for MA, LAM and Lemp in 72h after the
treatment, and at all times evaluated when compared to uninfected control. In conclusion,
HePC-PEG and HePC-PEG/MA formulations presented reduced vesicle sizes, electrical
stability, monodispersity and significant reduction in Leishmania infantum infection rates, in
vitro.
Palavras-chave
Leishmaniose visceral, Lipossomas, Tratamento, Miltefosina, Antimoniato de meglumina, Imunologia, Lipossomos, Doenças - Tratamento, Doenças - Tratamento, Lipossomos, Imunologia, Leishmaniose visceral
Citação
PORTA, Marcela Rodrigues de Sousa. Preparo, caracterização e eficácia in vitro de formulações lipossomais de circulação prolongada contendo Miltefosina e Antimonato de Meglumina para o tratamento da Leishmaniose Visceral. 2015. 55 f. Dissertação (Mestrado em Imunologia e Parasitologia Aplicadas) - Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 2018. DOI http://dx.doi.org/10.14393/ufu.di.2018.826