Publicação: Anticorpos IgY anti-Strongyloides venezuelensis: produção, caracterização e aplicação no imunodiagnóstico da estrongiloidiase humana
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CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::PARASITOLOGIA::HELMINTOLOGIA DE PARASITOS
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Autores
Orientador
Coorientador
Goulart, Luiz Ricardo
Resumo
Diante da realidade epidemiológica e do negligenciamento da estrongiloidíase humana, o
diagnóstico rápido e eficaz é uma condição de extrema importância. O desenvolvimento de
novas plataformas diagnósticas é essencial para evitar ou diminuir a manutenção de casos
crônicos e hiperinfecções disseminadas no curso desta geohelmintíase. A tecnologia IgY é
uma alternativa para a produção de anticorpos policlonais com elevado grau de especificidade
e rentabilidade. O objetivo do estudo foi produzir e fracionar anticorpos IgY provenientes de
gemas de ovos de galinhas poedeiras, imunizadas com extratos antigênicos de larvas
filarioides infectantes (iL3) e fêmeas partenogenéticas (Fp) de Strongyloides venezuelensis.
Os anticorpos IgY produzidos foram avaliados no reconhecimento de proteínas parasitárias,
cortes histológicos de formas de vida do parasita e no diagnóstico sorológico da
estrongiloidíase humana. Foram utilizados ainda para a seleção, por phage-display, de clones
de fagos com peptídeos expressos, ligantes das moléculas de IgY, para aplicação
imunodiagnóstica da doença. Cinco imunizações foram realizadas com adjuvantes de Freund
em intervalos de 14 dias. Ovos e amostras de soro foram obtidos para monitorar a produção
de anticorpos IgY específicos. As gemas dos ovos foram purificadas pelo método de diluição
em água, seguidas de precipitação de proteínas com sulfato de amônio e fracionamento em
cromatografia de interação tiofílica. O fracionamento e a especificidade dos anticorpos IgY
foram confirmados por testes dot-blot, eletroforese em gel de poliacrilamida, enzyme linked
immunosorbent assay (ELISA), ELISA avidez, immunoblotting e reações de
imunofluorescência indireta (RIFI). As aplicações no imunodiagnóstico da estrongiloidíase,
utilizando amostras de soro de pacientes, foram realizadas pela detecção de imunocomplexos
pelos anticorpos IgY em testes ELISA, e pela detecção de IgG circulante pelos clones de
fagos com peptídeos fusionados, selecionados em duas estratégias diferentes de biopanning,
por testes phage-ELISA. Bandas polipeptídicas das cadeias pesadas (65 kDa) e leves (22-24
kDa) das moléculas de IgY foram visualizadas em SDS-PAGE 12 %. A especificidade dos
anticorpos IgY foi confirmada pelo reconhecimento de bandas proteicas dos extratos
antigênicos totais e de estruturas em cortes histológicos de S. venezuelensis (iL3 e Fp). Os
anticorpos IgY apresentaram índices de avidez variando de 68,0 % a 95,4 %. A detecção de
imunocomplexos nas amostras de soros dos pacientes apresentaram valores diagnósticos de
sensibilidade (Se) e especificidade (Es) para IgY anti-iL3 e IgY anti-Fp respectivamente: Se:
95,56 % e Es: 88,89 %; Se: 95,56 % e Es: 91,11 %. As estratégias de biopanning
selecionaram clones de fagos que expressam peptídeos de estruturas similares a proteínas de
Strongyloides stercoralis, causador da infecção em seres humanos. Foram identificados seis
principais clones de fagos, sendo dois (C12 e D4) considerados com melhores valores
diagnósticos na detecção de IgG em amostras de soro de pacientes (D4 – Se: 82,2 %, Es: 83,3
%; C12 – Se: 80,0 % , Es: 82,2 %). A tecnologia IgY pode ser considerada uma importante
ferramenta no estudo da estrongiloidíase humana com possibilidades de aplicação no
diagnóstico sorológico e na terapêutica da doença.
Abstract
In view of the epidemiological problem of the neglected condition of human strongyloidiasis,
a rapid and effective diagnosis is extremely important. The development of new diagnostic
tools is essential to avoid hyperinfections and chronic cases in the course of this
geohelminthiasis. IgY technology is an alternative for antibody production with high
specificity and profitability. This study aimed to produce and fracionate IgY antibodies from
egg yolks of hens immunized with total antigenic extracts of Strongyloides venezuelensis
infectious filariform larvae (iL3) and parthenogenetic females (pF). The IgY antibodies
produced were evaluated by the recognition of parasitic proteins, life forms and serological
diagnosis of human strongyloidiasis. They were also used for the selection of phage clones
with expressed peptides binding of the IgY molecules by phage display, for
immunodiagnostic application of the disease. Five immunizations were performed with
Freund's adjuvants at 14-day interval. Eggs and serum samples were obtained to monitor the
production of specific antibodies. Egg yolks were purified by water dilution method and
protein precipitation by ammonium sulfate, followed by fractionation in tiophilic interaction
chromatography. The fractionation and antibodies specificity were confirmed by dot-blot,
electrophoresis, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), ELISA avidity,
immunoblotting and immunofluorescence antibody test (IFAT). Applications in the
immunodiagnostic of strongyloidiasis, using human serum samples, were performed by
detection of immune complexes with IgY antibodies by ELISA, and by detection of
circulating IgG, with peptide-fused clones selected in two different biopanning strategies, by
phage-ELISA. Proteins from heavy (65kDa) and light (22-24kDa) chains of IgY molecules
were visualized on 12 % SDS-PAGE. The specificity was confirmed by recognition of protein
bands from the total extracts and by IFAT in histological sections of S. venezuelensis (iL3 and
pF). Antibodies showed levels of avidity ranging from 68.0 % to 95.4 %. The detection of
immune complexes in serum samples showed diagnostic values of sensitivity (Se) and
specificity (Sp) for anti-iL3 IgY and anti-Fp IgY antibodies respectively: Se: 95.56 % and Sp:
88.89 %; Se: 95.56 % and Sp: 91.11 %. Biopanning strategies selected phage clones fusedpeptides
with structures similar to Strongyloides stercoralis proteins, which caused the
infection in humans. Six main phage clones were identified, being two (C12 and D4)
considered with the best diagnostic values for IgG detection in human serum samples (D4 -
Se: 82.2 %, Sp: 83.3 %, C12 - Se: 80.0 %, Sp: 82.2 %). IgY technology can be an important
tool for the strongyloidiasis study with possibilities for application in disease therapeutics and
as a serological diagnostic method.
Palavras-chave
Strongyloides stercoralis, Imunoglobulina Y, imunocomplexos, phage-display, imunodiagnóstico
Citação
FARIA, L. S. Anticorpos IgY anti-Strongyloides venezuelensis: produção, caracterização e aplicação no imunodiagnóstico da estrongiloidíase humana. 2017. 112 f. Tese (Doutorado em Imunologia e Parasitologia Aplicadas), Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 2017