Publicação: Imunogenicidade do veneno de Dinoponera australis
(Hymenoptera, Formicidae, Ponerinae)
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CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::GENETICA
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CAPITULO II: O gênero Dinoponera apresenta seis espécies, todas com distribuição pela
América do Sul. Essas formigas são caracterizadas pela presença de uma
glândula de veneno que é responsável pela produção de uma toxina, constituída
em sua maior parte por proteínas. Este trabalho teve como objetivo a identificação
de peptídeos específicos do veneno de D. australis por Phage Display. Foi
utilizada biblioteca comercial de peptídeos randômicos Ph.D.-12 Peptide 12-mer
Phage Display Library. Após quatro etapas de seleção, 48 clones tiveram sua
seqüência de DNA determinada e foram traduzidos, gerando 26 seqüências
válidas e 16 peptídeos distintos. As análises de bioinformática identificaram
similaridade com ADAM metaloprotease de Culex quinquefasciatus e com uma
proteína similar a fosfatase ácida de veneno encontrada em Nasonia vitripennis.
ADAM metaloproteases são proteínas que atuam no controle de adesão e fusão
de membrana, citocinas e fator de crescimento. Fosfatase ácida é uma das
maiores enzimas lisossomais de invertebrados associada com degradação e
morte celular. A atividade da Fosfatase ácida no veneno desta formiga foi feita
utilizando o Kit Api Zym. O mapeamento dos componentes do veneno de D.
australis, mostrou que os peptídeos analisados não apresentam similaridade com:
melitina de Apis mellifera e Vespa magnifica; maior alergeno de Myrmecia
pilosula; Apamin de A. melífera; fosfolipase A2 de A. melífera, mas apresentou
similaridade com fosfolipase A2 de Nasonia vitripennis. Apresentou, também,
similaridade com diferentes alergenos, neurotoxinas, metaloproteases,
fenoloxidase e hialuronidase de diferentes himenópteros. Para analisar o efeito
dos peptídeos usou se o teste edematogênico verificando que nos camundongos
imunizados apresentou maior nível edematogênico com 30 minutos, sendo,
portanto, mais rápido que em camundongos não imunizados. CAPITULO III: A análise dos componentes do veneno de himenópteras é uma fonte rica de
informação sobre as funções e mecanismos biológicos desse veneno. É
importante, também, por desencadear reações alérgicas em humanos e por
apresentar aplicações terapêuticas. As citocinas são um grupo heterogêneo de
mediadores celulares peptídicos associados à ativação do sistema imune e às
respostas inflamatórias. Os receptores Toll-like (TLRs) são proteínas
transmembranas caracterizadas por seqüências extracelulares repetidas ricas em
leucina, capazes de reconhecer um amplo grupo de padrões moleculares
associados à patógenos (PAMPs) de diferentes espécies de microrganismos e
fundamentais para a ativação da resposta imune inata. Este trabalho analisou o
perfil de resposta imunológica em células sanguíneas, in vitro, estimulado por
veneno de Dinoponera australis em diferentes concentrações (0.5; 1;e 3 ug) e
analisou, também, o efeito das mesmas concentrações de veneno bruto na
expressão do mRNA do gene TLR4 em células mononucleares de sangue
periférico (PBMC) por PCR Tempo Real. Sangue humano foi obtido de doadores
voluntários, coletados em tubos contendo heparina. As citocinas presentes nos
sobrenadantes de cultura de sangue periférico foram dosadas por ELISA
utilizando pares de anticorpos monoclonais comercialmente disponíveis. O
veneno bruto em todas as concentrações analisadas estimulou significativamente
a produção de IL-10 em cultura de sangue total e diminuição de TNF-α. A IL-10
tem uma alta atividade anti-inflamatória tanto nas funções de linfócitos como de
monócitos. Esta citocina diminui a produção de uma série de citocinas próinflamatorias
como IL1, TNF-α e IL6. Os níveis de expressão gênica do TRL4
foram determinados por PCR tempo-real e normalizados com os níveis de
expressão do gene constitutivo HPRT. Houve uma diminuição significativa na
expressão do mRNA do gene TLR4 em cultura de PBMC humano somente na
concentração de 3μg. Esses dados sugerem que algum componente do veneno
bruto dessa formiga tem efeito modulador na expressão de TLR4 e potente efeito
antiinflamatório.
Abstract
CHAPTER II: The Dinoponera presents six species, all with distribution by South America.
These ants are characterized by the presence of a venom gland, which is
responsible for the production of a toxin, consists for the most part by proteins.
This work was aimed at the identification of specific peptides of the venom of D.
australis by Phage Display. It was used commercial library of random peptides
Ph.D.-12 Peptide 12-mer Phage Display Library. After four stages of selection, 48
clones had their DNA sequence determined and have been translated, generating
26 valid sequences and 16 different peptides. Analyses of bioinformatics identified
similarity with ADAM metaloprotease of Culex quinquefasciatus and with a protein
similar to acid phosphatase of venom found in Nasonia vitripennis. ADAM
metalloproteases are proteins that act in control of accession and of membrane
fusion, cytokine and growth factor. Acid Phosphatase is one of the largest of
invertebrates Lysosomal enzymes associated with degradation and cell death. The
activity of Phosphatase acid in this ant venom was made using the kit Api Zym.
The mapping of the components of the venom of D. australis, showed that the
peptides tested not have similarity to: mellitin of Apis mellifera and Vespa
magnifica; largest allergen of Myrmecia pilosula; Apamin of A. mellifera;
phospholipase A2 from A. melífera, but showed similarity with phospholipase A2
from Nasonia vitripennis. He also similarity with different allergens, neurotoxinas,
metalloproteases, fenoloxidase and hialuronidase of different hymenopters. To
examine the effect of peptides used if the test edematogênico noting that the
immunized mice showed higher edematogênico level with 30 minutes and
therefore faster than mice not immunized. CHAPTER III: The analysis of the components of the venom of himenopteras is a rich source of
information on the functions and mechanisms of biological poison. It is important,
also, for trigger allergic reactions in humans and to present therapeutic
applications. The cytokines are a heterogeneous group of mediators cellular
peptídicos associated with activation of the immune system and inflammatory
responses. The Toll-like receptors (TLRs) are proteins transmembranas
characterized by repeated sequences extracellular leucine-rich, capable of
recognizing a broad group of pathogens associated with the molecular patterns
(PAMPs) of different species of microorganisms and essential for the activation of
the innate immune response. This study examined the profile of immune response
in blood cells in vitro, stimulated by venom of Dinoponera australis in different
concentrations (0.5, 1 and 3 mg) and examined, also, the effect of the same
concentrations of poisonous raw in the expression of mRNA the gene TLR4 in
peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by Real Time PCR. Human blood was
obtained from volunteer donors, collected in tubes containing heparin. The
cytokines in culture supernatants of peripheral blood were measured by ELISA
using pairs of monoclonal antibodies commercially available. The venom at all
concentrations tested significantly stimulated the production of IL-10 in culture of
whole blood and reduction of TNF-α. The IL-10 has a high anti-inflammatory
activity both in the function of lymphocytes as monocytes. This decreases the
cytokine production of a series of pro-inflammatory cytokines as IL1, TNF-α and
IL6. The levels of gene expression of TRL4 were determined by real-time PCR
and normalized to the levels of expression of the gene constituent HPRT. There
was a significant decrease in the expression of mRNA of the gene TLR4 in culture
of human PBMC only to the concentration of 3 g μ These data suggest that some
component of crude that ant poison takes effect in modulating the expression of
TLR4 and potent antiinflammatory effect.
Palavras-chave
Veneno, Dinoponera australis, TLR4, Citocinas, Phage display, Venom, Cytokines, Genética molecular
Citação
SANTANA, Flávia Assumpção. Imunogenicidade do veneno de Dinoponera australis
(Hymenoptera, Formicidae, Ponerinae). 2008. 78 f. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas) - Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 2008.