Publicação: Manipulação gênica do protozoário Neospora caninum como ferramenta para o estudo das interações parasito-hospedeiro
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CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::IMUNOLOGIA
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Bradley, Peter John
Resumo
Neospora caninum é um parasito intracelular obrigatório pertencente ao filo
Apicomplexa, caracterizado pela presença do complexo apical composto por proteínas
de micronemas, roptrias e grânulos densos, utilizadas pelo parasito durante o processo
de adesão e invasão da célula hospedeira, caracterizando o principal evento na
patogênese da infecção por N. caninum e por outros parasitos do filo Apicomplexa,
influenciando assim na biologia do parasito e na interação parasito-hospedeiro. Dessa
forma, ferramentas moleculares tem sido desenvolvidas na tentativa de se identificar e
caracterizar esses possíveis fatores de virulência. Portanto, o presente trabalho buscou
desenvolver ferramentas moleculares especificas para N. caninum de modo a melhorar a
eficiência na manipulação genética deste parasito, sendo assim desenvolvemos N.
caninum depletado geneticamente para a roptria Rop9 por meio da utilização do
plasmídeo CRISPR-Cas9 pU6-Universal de T. gondii modificado pela inserção de
Ku80. O parasito depletado para Rop9 mostrou-se importante durante a fase inicial da
invasão e replicação do parasito, entretanto não foi caracterizado como um potencial
fator de virulência para N. caninum. Complementarmente, proteínas de T. gondii foram
expressas em N. caninum utilizando vetores específicos para este parasito, apresentando
um sistema heterólogo para estudo de proteínas presentes em Toxoplasma. Pois, Gra15
ou Gra24 de T. gondii tipo II, e Rop16 de T. gondii tipo I foram expressos em
taquizoítos de N. caninum de forma estável e mantiveram o seu fenótipo biológico
como já apresentado pelo parasito de origem, que expressa naturalmente estas proteínas.
Adicionalmente, foi observado que N. caninum induziu a ativação do inflamassoma
através da via NLRP3, ASC e Caspase-1. Sendo a via IL-1R/ MyD88 uma via indireta
importante no controle da replicação do parasito. Além disso, foi demonstrado que essa
ativação é dependente de efluxo de potássio, e que diferentes cepas de N. caninum
mantêm esse perfil de ativação. No entanto, cepas de T. gondii bloqueiam essa ativação
sendo necessário um primeiro sinal para acionar a via do inflamassoma. Foi identificado
Rop16 de T. gondii da cepa tipo I como responsável por bloquear essa ativação, de
modo dependente a ativação de STAT3. Portanto, as ferramentas moleculares
desenvolvidas e aplicadas em N. caninum revelaram-se úteis para identificar e
caracterizar fatores de virulência envolvidos na patogênese por estes dois protozoários.
Abstract
Neospora caninum is an obligate intracellular parasite classified in the phylum
Apicomplexa, characterized by the presence of the apical complex composed by
micronemes proteins, rhoptries and dense granules, used by parasite during the adhesion
and invasion process of the host cell. This is the mean event in infection pathogenesis
generated by N. caninum and other parasites from the phylum Apicomplexa, promoting
influence in the parasite biology and the interface between the parasite and its host.
Therefore, molecular tools have been developed in order to identify and characterize
these possible virulence factors. Thus, the present study sought to establish a specific
system of genetic manipulation of N. caninum, searching for the improvement of the
genetics manipulation of this parasite. So, we developed genetically depleted N.
caninum to Rop9 rhoptry using the pU6-Universal CRISPR-Cas9 plasmid of T. gondii
modified by the insertion of Ku80. The Rop9 depleted parasite showed important during
initial phase of invasion and replication of the parasite, however it was not characterized
as a potential virulence fator for N. caninum. Furthermore, T. gondii proteins were
expressed in N. caninum by the use of specific vectors for this parasite, showing an
heterologous system for the study of Toxoplasma proteins, due to the fact that Gra15 or
Gra24 of type II T. gondii and Rop16 of type I T. gondii were expressed in N. caninum
tachyzoites in a stable way and keept its biological phenotype, as already presented the
former parasite, that naturaly expresses these proteins. In addition, it was observed that
N. caninum induced an inflammasome activation through NLRP3, ASC and Caspase-1.
IL-1R/MyD88 demonstrated an indirect pathway in the control of parasite replication.
Furthermore, it was observed that this activation is dependent of the potassium efflux
and that different strains of N. caninum keep this activation profile. However, T. gondii
strains block this activation, making necessary a prior signal in order to active the
inflamosome pathway. Type I T. gondii Rop16 was identified as responsible for
blocking this activation, in a dependent way to the STAT3 activation. Therefore, the
development of molecular tools and their application in N. caninum may prove to be
useful to identify and characterize virulent factors involved in the pathogenesis by these
two protozoans.
Palavras-chave
Imunologia, Genética, Toxoplasma gondii, Neospora, Manipulação genética, N. caninum, T. gondii, Resposta imune, Inflamassoma
Citação
MOTA, Caroline Martins. Manipulação gênica do protozoário Neospora caninum como
ferramenta para o estudo das interações parasito-hospedeiro. 2016. 115 f. Tese (Doutorado em Imunologia e Parasitologia Aplicadas) - Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 2016. DOI https://doi.org/10.14393/ufu.te.2016.130