Publicação: A proteína P21 de Trypanosoma cruzi das cepas G e Y apresenta atividade pleiotrópica na invasão, multiplicação celular, eclosão in vitro e no parasitismo tecidual in vivo
Carregando...
Tipo do documento
Data
Direito de acesso
Área do conhecimento
CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Autores
Orientador
Coorientador
Borges, Bruna Cristina, Silva, Marcelo José Barbosa
Resumo
A P21 é uma proteína secretada por todas as formas evolutivas de Trypanosoma cruzi com
atividade biológica reconhecida. No entanto, ainda não é claro o impacto desta proteína na
interação T. cruzi-hospedeiro. Em nossos estudos anteriores, realizamos pesquisas com a forma
recombinante da P21, onde demonstramos que provavelmente, ela esteja envolvida na invasão
e multiplicação celular. Com isso, a fim de avaliar o efeito desta proteína sobre a invasão,
multiplicação e eclosão, geramos parasitas que não expressam à P21 da cepa pouco virulenta
(cepa G) e da virulenta (cepa Y). Conduzimos experimentos in vitro nas linhagens celular Vero
e C2C12, infectadas com tripomastigotas derivados de cultura em tecidos (TCT) nocaute à P21
(TcP21-/- da cepa G e da cepa Y) e parasitas parentais de ambas as cepas como controle
(expressam a proteína Cas9). Realizamos também experimentos em modelo mais complexos,
in vivo em camundongos C57BL/6 INF𝛾-/- (nocaute ao INF𝛾) e BALB/c infectados com TCT
da cepa G e Y (nocaute a P21 e controle), respetivamente. A invasão e multiplicação (24, 48,
72 e 96 horas) foram determinadas pelo método de coloração com Giemsa e por qPCR
determinamos o DNA de T. cruzi dos experimentos de multiplicação. Determinamos a eclosão
por contagem em microscopia a partir das 72 às 240 horas pós-infecção (hpi). Quanto aos
experimentos in vivo, após a infecção dos animais, coletamos sangue da veia caudal de três em
três dias até ao 15º dias pós-infecção (dpi). Após a eutanásia, coletamos o coração para
quantificar o DNA de T. cruzi por qPCR e análise histopatológica. Em célula Vero e C2C12,
observamos que os parasitas TcP21-/- da cepa G invadiram significativamente menos.
Multiplicaram significativamente menos as 96 horas em célula Vero e de maneira similar na
célula C2C12. Por outro lado, os parasitas TcP21-/- e parentais da cepa Y invadiram e
multiplicaram de forma similar em célula Vero. Em célula C2C12 os parasitas da cepa Y TcP21-
/- invadiram significativamente menos a célula hospedeira e na multiplicação apresentaram
significativamente menor percentagem de célula invadida as 72 horas. A qPCR realizada em
célula Vero infectada com parasitas TcP21-/- da cepa G demonstrou significativamente menor
taxa de multiplicação nos tempos de 24, 48 e 96 horas. E na linhagem celular C2C12 infectada
com parasitas da cepa G TcP21-/- no tempo de 72 horas observamos significativamente menor
quantidade de DNA de T. cruzi enquanto na mesma linhagem célular infectada com parasitas
da cepa Y TcP21-/- no tempo de 72 horas observamos significativamente maior quantidade de
DNA de T. cruzi. A eclosão de tripomastigotas (cepa G) em célula Vero foi significativamente
menor nos parasitas TcP21-/- em comparação aos controles a partir das 168 hpi e de amastigotas
foi significativamente maior às 240 hpi nos parasitas TcP21-/-. Na célula C2C12, infetada com
a cepa Y observamos maior eclosão de TCT e amastigotas nos parasitas TcP21-/-, mas foi
significativa no tempo de 144 hpi nos TCT. In vivo, não observamos parasitemia sistêmica
patente nos animais infectados com TCT da cepa G. Quanto aos animais infectados com a cepa
Y observamos parasitemia detetável, significativamente maior nos animais infectados com
parasitas TcP21-/- do 3º ao 6º dpi. A qPCR do tecido cardíaco, nos animais infectados com a
cepa G demonstrou quantidade de DNA de T. cruzi significativamente menor nos parasitas
TcP21-/-. Na cepa Y observamos quantidade de DNA significativamente maior nos parasitas
TcP21-/-. A resposta inflamatória no tecido cardíaco de animais infectados com a cepa G foi
baixa/média nos TcP21-/- e parentais. No tecido cardíaco infectado com cepa Y TcP21-/-
observamos qualitativamente maior predominância de neutrófilos, macrófagos, corpos
apoptóticos e grande número de ninhos de amastigotas. Diante disso, podemos afirmar que à
P21, provavelmente seja importante na interação patógeno-hospedeiro durante a invasão,
multiplicação celular e eclosão. E que possivelmente faça parte do mecanismo que promove a
infecção crônica sem parasitemia sistémica patente, agindo de forma diferente a depender da
célula hospedeira, forma infectiva e da linhagem filogenética do parasita.
Abstract
P21 is a protein secreted by all forms of Trypanosoma cruzi with recognized biological activity.
However, the impact of this protein on the cell cycle in this protozoan is still unclear. In our
previous studies, we carried out research with the recombinant form of P21, where we
demonstrated that it is probably involved in cell invasion and multiplication. Therefore, in order
to evaluate the effect of this protein on invasion, multiplication and egress, we generated
parasites that do not express (knockout) P21 of the low virulent strain (G strain) and the highly
virulent strain (Y strain). Then, we conducted in vitro experiments in Vero and C2C12 cells,
infected with tissue culture-derived trypomastigotes (TCT) knockout for P21 (TcP21-/- of strain
G and strain Y) and parental parasites of both strains as control (express the Cas9 protein). Also
performed in vivo experiments in C57BL/6 INF𝛾-/- (knockout for INF𝛾) and BALB/c mice
infected with TCT G and Y strain, respectively. Invasion and multiplication were performed
using the Giemsa staining method, and multiplication was also evaluated by qPCR (24, 48, 72
and 96 hours). Egress was determined by microscopy counting from 72 to 240 hours postinfection. As for in vivo experiments, after the animals were infected, we collected blood from
the tail vein every three days until the 15th day post-infection (dpi). After euthanasia, the heart
was collected to quantify the parasite DNA by qPCR and for histopathological analysis. In Vero
and C2C12 cells, we observed that TcP21-/- strain G parasites invaded significantly less. The
96 hours multiplied significantly less in the Vero cell and similarly in the C2C12 cell. On the
other hand, TcP21-/- and parental Y strain parasites invaded and multiplied similarly in Vero
cells and invaded significantly less in C2C12 cells. qPCR performed on Vero cells infected
with TcP21-/- strain G parasites demonstrated a significantly lower multiplication rate at 24, 48
and 96 hours. And in the C2C12 cell line infected with strain G and Y, we observed a
significantly lower amount of T. cruzi DNA in TcP21-/- parasites after 72 hours. The egress of
trypomastigotes (strain G) in Vero cells was significantly lower in TcP21-/- parasites compared
to controls from 168 hpi and amastigotes was significantly higher at 240 hpi in TcP21-/-
parasites. In the C2C12 cell, infected with strain Y, we observed greater egress of TCT and
amastigotes in TcP21-/- parasites, but it was significant at 144 hpi in TCT. In vivo, we did not
observe patent systemic parasitemia in animals infected with TCT from G strain, as for animals
infected with Y strain, we observed patent parasitemia, significantly higher in TcP21-/- parasites
from the 3rd to the 6th dpi. The qPCR of heart tissue, in animals infected with G strain, we
observed a significantly lower quantity of T. cruzi DNA in TcP21-/- parasites. In Y strain, we
observed a significantly higher quantity of DNA in TcP21-/- parasites. The inflammatory
response in the heart tissue of animals infected with the G strain was low/medium in TcP21-/-
and parental parasites. While in the cardiac tissue infected with Y strain TcP21-/-, we
qualitatively observed a higher predominance of neutrophils, macrophages, apoptotic bodies
and a large number of amastigote nests. Therewith, we assume that P21 is probably important
in the pathogen-host interaction during invasion, cell multiplication and egress. Probably be
part of the mechanism that promotes chronic infection without patent systemic parasitemia and
acting differently depending on the cell line host and parasite phylogenetic lineage.
Palavras-chave
Trypanosoma cruzi, CRISPR/Cas9, interação patógeno-hospedeiro, invasão celular, multiplicação intracelular, virulência, parasite-host interaction, cell invasion, intracellular multiplication, virulence
Citação
UOMBE, Nelsa Paula Inacio. A proteína P21 de Trypanosoma cruzi das cepas G e Y apresenta atividade pleiotrópica na invasão, multiplicação celular, eclosão in vitro e no parasitismo tecidual in vivo. 2024. 118 f. Dissertação (Mestrado em Imunologia e Parasitologia Aplicadas) - Universidade Federal de Uberlândia. Uberlândia, 2024. DOI http://doi.org/10.14393/ufu.di.2023.8121