Por favor, use este identificador para citar o enlazar este ítem: https://repositorio.ufu.br/handle/123456789/27210
Tipo de documento: Dissertação
Tipo de acceso: Acesso Aberto
Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 United States
Título: Caracterização parcial de uma fração enriquecida em atividade ATP/GTPase obtida a partir de testículo de coelho
Título (s) alternativo (s): Partial characterization of an ATP / GTPase activity-enriched fraction obtained from rabbit testis
Autor: Patussi, Eliana Valéria
Primer orientador: Coelho, Milton Vieira
Resumen: Neste trabalho foi isolado e caracterizado parcialmente uma fração de testículo de coelho em fosfocelulose enriquecida em atividade ATP/GTPase. Os testículos foram homogeneizados em tampão I (Imidazol-Cl 50 mM, EDTA 10 mM, EGTA 10 mM, DTT 1.0 mM, PMSF 0.3 mM e benzamidina 1 mM) pH 8.5 e centrifugado a 15.000g x 40 min. O sobrenadante foi aplicado em coluna de DEAE-Sepharose. Proteínas retidas foram eluídas com tampão Imidazol-Cl 50 mM, pH 6.5 e o eluato foi aplicado em coluna de fosfocelulose. A fração enriquecida em atividade ATPase foi obtida eluindo-se a coluna com tampão Imidazol-Cl, pH 8.0. Esta atividade não foi retida por uma coluna de GTP-aAga frroasçeã.o isolada de testículo de coelho possui as seguintes propriedades. 1) Em altas concentrações (mM) de substrato, a atividade GTPase é maior do que a ATPase. Em baixas concentrações os dois nucleotídeos são hidrolisados indistintamente. 2) Ambas as atividades ocorrem como de Ca++. Nos dois casos, a atividade Ca/Nucleotidase foi maior do que a atividade Mg/Nucleotidase. 3) Diferentemennte de uma fração correspondente obtida a partir de cérebro de rato (Coelho, 1988), a atividade MgATPase não Ca++/CaM. 4) A atividade ATPase é estável em baixa temperatura (4 «C/7 dias), mas é totalmente perdida quando aquecida (75 °C/ 5') ou congelada (-20 »C). 5) Não possui atividade (K-EDTA)ATPase 6) A atividade MgATPase não foi sensível a altas concentrações de sal (NaCl ou KC10 3 M) Triton X-100 0.2%, azida 1 mM ou NaVO, 250 pM. Contudo, foi inibida cerca de 80% por A1F3 (NaF 2.4 mM/ A1C1, 0.1 mM) e 35% na Presença de Na VO, 1 mM ou NaF 5 mM. No gel, observou-se que os polipeptídeos: 160, 100, 74 e 48 kDa apareceram no "flow through" da coiuna de GTP-agarose juntamente com a r • cAmplhante a atividade da fração PC. No eluato atividade MgATPase que foi semelhan r «ujpnq- 32 e 16 kDa, que não apresentaram detectou-se sómente dois polipeptídeos. apresentou estimulação poratividade MgGTPase. Estes dois polipeptídeos podem corresponder às pequenas proteínas G citoplasmáticas, que participam na organização do citoesqueleto e controle do transporte vesicular. Os resultados aqui apresentados mostram a caracterização parcial de uma Mg/Ca nucleotidase trifosfatásica de testículo de mamíferos e levanta a possibilidade de estudo de proteínas relacionadas as vias de mecanotransdução e transdução de sinal.
Abstract: In this work we isolated and partially characterized a fraction of rabbit testis containing the ATPase/GTPase activity by using a phosphocellulose column. Testis was homogenated in 50mM Imidazole pH 8.5 with 10 mM EDTA/EGTA, 1.0 mM DTT, 0.3 mM PMSF, 1.0 mM benzamidine, and then centrifuged by 15.000g for 40 min. The supematant was loaded in DEAE-Sepharose column. Bound proteins were eluted with 50 mM Imidazole pH 6.5 and the eluate was directly loaded in a phosphocellulose column. The fraction containing ATPase activity was then eluated with 50 mM Imidazole pH 8.0. No proteins were retained in GTP-agarose column. The isolated fraction presented the following properties. 1) At high concentrations (mM) of ATP or GTP, GTPase larger than ATPase activity. At low substrate concentrations both nucleotides are indistinctly hidrolyzed. 2) Both activities were dependent on the presence of Mg++ or Ca++. In both cases, the Ca++-nucleotidase was larger of than Mg++-nucleotidase activity. 3) Ehfferenttly from the corresponding fraction isolated from rat brain (Coelho, 1988), Mg++ATPase activity presented no stimulation by Ca++-CaM. 4) ATPase activity is well preserved when stored at 4 to 10 «C by one week, but not at 75 »C by 5 minutes or in a freezer at -20 °C. 5) (K+-EDTA)ATPase activity was not detected. 6) Mg-ATPase activity was not sensitive to high salt concentrations (0.3 M KC1 or NaCl), 0.2 % Triton X-100, 1.0 mM azide w 250 nM NaVO3. However, it was 80% inhibited by A1F3 (2.4 mM NaF/ 0.1 mM AlClj) and 35 % in presence ofthe 1 mM NaVO3 or 5 mM NaF. . 1 4. tn GTP-agarose column were analyzed in Some polypeptides not bound to Utr agaiu , O0 J60 100 74 e 48 kDa bands. The column SDS-PAGE and caractenzed as 160, . ^tained just two polypeptides, with 32 and 16 kDa, that didn’t e i ite SMÍ.Í ilial ” lhe vesicle transport. The proteins here described may have a participation in mechanotransduction and signalization events, for what they still need more investigation.
Palabras clave: Citoesqueleto
Miosina
Dineína
Cinesina
Dinamina
Área (s) del CNPq: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::IMUNOLOGIA
Idioma: por
País: Brasil
Editora: Universidade Federal de Uberlândia
Programa: Programa de Pós-graduação em Imunologia e Parasitologia Aplicadas
Cita: PATUSSI, Eliana Valéria. Caracterização parcial de uma fração enriquecida em atividade ATP/GTPase obtida a partir de testículo de coelho. 1996. 99 f. Dissertação (Mestrado Imunologia e Parasitologia Aplicadas) - Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 2019. Disponível em: http://dx.doi.org/10.14393/ufu.di.1996.5
Identificador del documento: http://dx.doi.org/10.14393/ufu.di.1996.5
URI: https://repositorio.ufu.br/handle/123456789/27210
Fecha de defensa: 1996
Aparece en las colecciones:DISSERTAÇÃO - Imunologia e Parasitologia Aplicadas

Ficheros en este ítem:
Fichero Descripción TamañoFormato 
CaracterizaçãoParcialFração.pdf3.76 MBAdobe PDFVista previa
Visualizar/Abrir


Este ítem está sujeto a una licencia Creative Commons Licencia Creative Commons Creative Commons