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Document type: Dissertação
Access type: Acesso Embargado
Title: Caracterização molecular e avaliação da infectividade in vitro e in vivo de duas cepas de Leishmania spp. isoladas de cães naturalmente infectados
Alternate title (s): Molecular characterization and evaluation of in vitro and in vivo infectivity of two strains of Leishmania spp. isolated from naturally infected dogs
Author: Oliveira, Marco Miguel de
First Advisor: Silva, Sydnei Magno da
First member of the Committee: Alves, Ceres Luciana
Second member of the Committee: Paula, Renata Cristina de
Summary: As leishmanioses podem assumir duas principais formas clínicas: leishmaniose visceral (LV) e leishmaniose cutânea (LC). Em áreas urbanas, o cão participa como reservatório de Leishmania infantum (causadora da LV) e, devido a isso, é alvo das estratégias de controle da doença. Esses animais também podem ser encontrados naturalmente infectados pelas espécies que levam o desenvolvimento de LC. Embora essas infecções sejam raras, alguns achados da literatura têm aberto o questionamento sobre o papel desses animais no ciclo biológico dessas espécies e o potencial infectivo das mesmas. Assim, torna-se importante a caracterização molecular e avaliação do comportamento infectivo desses parasitos. O presente estudo objetivou a identificação da espécie de duas cepas selvagens isoladas de cães procedentes do município de Uberlândia (MG), bem como a avaliação do seu comportamento in vitro e infectividade à macrófagos caninos de linhagem comercial e camundongos BALB/c. Para tal, os produtos de amplificação dos alvos ITS1 e hsp70 de Leishmania spp. foram submetidos a restrição enzimática (PCR-RFLP). O perfil de proliferação in vitro foi estabelecido pela curva de crescimento, sendo UDI-1 e UDI-2 comparadas à duas cepas de referência, Ba199 (MHOM/BR/1989/Ba199 – L. amazonensis) e BH401 (MCAN/BR/2002/BH401 – L. infantum). Nos experimentos de infectividade in vitro foram utilizados macrófagos (DH82), bem como formas promastigotas de fase estacionária e amastigotas axênicas das cepas selvagens e de referência. A avaliação da infecção in vivo foi verificada através da análise da carga parasitária no fígado, baço e lesão de camundongos infectados com as quatro linhagens de parasitos (UDI-1, UDI-2, Ba199, BH401). Além disso, foi verificada a cinética da infecção por acompanhamento do peso, tamanho da lesão e comportamento. Os resultados da PCR-RFLP mostraram que UDI-1 apresentou um perfil de pares de bandas similar à L. amazonensis e UDI-2 à L. infantum. O comportamento in vitro diferiu entre UDI-2 e BH401, sendo similar entre UDI-1 e Ba199. Promastigotas de fase estacionária de UDI-1 apresentaram a maior capacidade infectiva em comparação às demais cepas, sendo que quando utilizadas formas amastigotas axênicas, BH401 foi a cepa que apresentou o maior índice de infectividade. Em ambos os casos, UDI-2 mostrou a menor infectividade in vitro. In vivo, UDI-1 induziu lesões mais rapidamente (três semanas) e apresentou uma carga parasitária média maior na lesão e no fígado, em comparação à Ba199. Foi comprovado o fenótipo metastático, com consequente visceralização de UDI-1. Em oposição, os valores médios da carga parasitária de UDI-2 foram menores do que os de BH401 nos tecidos avaliados (fígado e baço). Não foram observadas alterações comportamentais e no ganho natural de peso. Em conjunto, esses dados mostram que entre as cepas selvagens, UDI-1 apresenta a melhor capacidade infectiva in vitro e in vivo, sendo que UDI-2 exibiu o fenótipo menos infectivo. Além disso, este é o primeiro relato sobre a infecção natural de um cão com L. amazonensis na região do Triângulo Mineiro (MG).
Abstract: Leishmaniasis can take on two main clinical forms: visceral leishmaniasis (VL) and cutaneous leishmaniasis (LC). In urban areas, the dog participates as a reservoir of Leishmania infantum (causing LV) and, because of this, is the target of the disease control strategies. These animals can also be found naturally infected by the species that lead to the development of LC. Although these infections are rare, some findings in the literature have opened the question about the role of these animals in the biological cycle of these species and their infective potential. Thus, it becomes important the molecular characterization and evaluation of the infective behavior of these parasites. The present study aimed to identify the species of two wild strains isolated from dogs from the city of Uberlândia (MG), as well as the evaluation of their in vitro behavior and infectivity to canine macrophages of commercial lineage and BALB / c mice. To this end, the amplification products of the ITS1 and hsp70 targets of Leishmania spp. were subjected to enzyme restriction (PCR-RFLP). The in vitro proliferation profile was established by the growth curve, with UDI-1 and UDI-2 being compared to two reference strains, Ba199 (MHOM/BR/1989/Ba199 - L. amazonensis) and BH401 (MCAN/BR/2002/BH401 - L. infantum). In vitro infectivity experiments were performed using macrophages (DH82), as well as promastigotes of stationary phase and axenic amastigotes of wild and reference strains. In vivo evaluation of the infection was verified by analyzing the parasite load in the liver, spleen and lesions of mice infected with the four parasite strains (UDI-1, UDI-2, Ba199, BH401). In addition, the infection kinetics were verified by weight monitoring, lesion size and behavior. The results of PCR-RFLP showed that UDI-1 presented a profile of pairs of bands similar to L. amazonensis and UDI-2 to L. infantum. The in vitro behavior differed between UDI-2 and BH401, being similar between UDI-1 and Ba199. Stationary phase promastigotes of UDI-1 showed the highest infectivity capacity compared to the other strains, and when using axenic amastigote forms, BH401 was the strain with the highest infectivity index. In both cases, UDI-2 showed the lowest infectivity in vitro. In vivo, UDI-1 induced lesions more rapidly (three weeks) and had a higher mean parasitic load on lesion and liver compared to Ba199. The metastatic phenotype was verified, with consequent visceralization of UDI-1. In contrast, the mean values of the parasitic load of UDI-2 were lower than those of BH401 in the evaluated tissues (liver and spleen). No behavioral changes and no natural gain were observed. Together, these data show that among the wild strains, UDI-1 shows the best infectivity capacity in vitro and in vivo, and UDI-2 exhibited the least infective phenotype. In addition, this is the first report on the natural infection of a dog with L. amazonensis in the Triângulo Mineiro (MG) region.
Keywords: Infecção
Macrófagos caninos
Curva de crescimento
Carga parasitária
Visceralização
Infection
Canine macrophages
Growth curve
Parasite load
Visceralization
Imunologia
Cão - Doenças
Leishmanioses
Infecção
Area (s) of CNPq: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::PARASITOLOGIA::PROTOZOOLOGIA DE PARASITOS
Language: por
Country: Brasil
Publisher: Universidade Federal de Uberlândia
Program: Programa de Pós-graduação em Imunologia e Parasitologia Aplicadas
Quote: OLIVEIRA, Marco Miguel de. Caracterização molecular e avaliação da infectividade in vitro e in vivo de duas cepas de Leishmania spp. isoladas de cães naturalmente infectados. 2018. 85 f. Dissertação (Mestrado em Imunologia e Parasitologia Aplicadas) - Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 2018. Disponível em: http://dx.doi.org/10.14393/ufu.di.2018.803
Document identifier: http://dx.doi.org/10.14393/ufu.di.2018.803
URI: https://repositorio.ufu.br/handle/123456789/22163
Date of defense: 26-Jul-2018
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