Please use this identifier to cite or link to this item: https://repositorio.ufu.br/handle/123456789/21696
Document type: Tese
Access type: Acesso Aberto
Title: Estudo das alterações no potencial de repouso neuronal induzidas por prostaglandina E2 em culturas primárias de gânglio da raiz dorsal de ratos por meio de microscopia de fluorescência
Alternate title (s): Study of changes in neuronal resting potential induced by prostaglandin E2 in primary cultures of the dorsal root ganglia of mice by means of fluorescence microscopy
Author: Santos, Débora de Oliveira
First Advisor: Lotufo, Celina Monteiro da Cruz
First member of the Committee: Funez, Mani Indiana
Second member of the Committee: Rodrigues, Aldo Rogelis Aquiles
Third member of the Committee: Miguel, Tarciso Tadeu
Fourth member of the Committee: Vieira, Alexandre Antônio
Summary: Introdução: A prostaglandina E2 (PGE2) é um mediador inflamatório capaz de sensibilizar os neurônios sensoriais periféricos e provocar hiperalgesia. Trabalhos sugerem que o mecanismo molecular envolvido na sensibilização por PGE2 é dependente da ativação da via adenilato cliclase/AMPc/PKA e também de modificações em canais iônicos, como os canais de potássio (K+). Objetivos: Estudar a despolarização induzida por PGE2 em culturas de neurônios sensoriais primários utilizando microscopia de fluorescência, como possível modelo para estudos da sensibilização dos nociceptores e avaliar o envolvimento de canais de K+ neste processo. Material e Métodos: Foram realizadas culturas primárias de neurônios dos gânglios da raiz dorsal (GRD) de ratos adultos e as variações no potencial de membrana foram registradas por microscopia confocal através da variação de fluorescência emitida pelos neurônios na presença do indicador DiBAC4(3). Avaliou-se o efeito da administração de PGE2, db-AMPc (análogo de AMPc), H89 (inibidor de PKA), morfina e dos bloqueadores de canais de K+: glibenclamida, TEA e 4-AP nos neurônios em cultura. Também foi avaliado o potencial de membrana de neurônios isolados de animais tratados in vivo por injeção intraplantar de PGE2. Resultados: A PGE2 (1, 10 e 100 nM) despolarizou os neurônios de maneira dependente da concentração, e esse efeito ocorreu predominantemente nos neurônios de menor diâmetro (10 a 20 µm). Além disso, em culturas de neurônios obtidas de gânglios da raiz dorsal (L4 e L5) ipsilaterais ao tratamento por via intraplantar com PGE2 (100 ng), verificou-se uma despolarização maior em relação a neurônios isolados de gânglios contralaterais dos mesmos animais, evidenciando uma correlação entre o efeito in vivo e in vitro de PGE2. Com relação ao envolvimento da via adenilato cliclase/AMPc/PKA na sensibilização dos neurônios sensoriais por PGE2, observou-se que a administração de db-AMPc induziu despolarização de forma semelhante ao observado com PGE2 (100 nM) e que a despolarização induzida por PGE2 é inibida na presença de H89. Foram testados também os efeitos de inibidores seletivos de canais de K+ e observou-se que a 4-AP, um bloqueador de canais do tipo A, despolarizou neurônios de maneira semelhante à PGE2. Além disso, observou-se que a PGE2 não apresenta efeito após despolarização induzida por 4-AP e este também não altera o potencial de membrana de neurônios previamente despolarizados por PGE2. Estes resultados indicam que PGE2 e 4-AP atuam sobre os mesmo canais de K+. Foi testado também o efeito da morfina, analgésico cujo efeito periférico é dependente da abertura de canais de K+ sensíveis ao ATP, e os resultados encontrados mostraram que a morfina inibe a despolarização induzida por PGE2 e também por 4-AP, evidenciando que a PGE2 e a morfina atuam sobre canais de K+ diferentes. Conclusão: Em conclusão, a PGE2 despolarizou os neurônios do GRD de maneira dependente da concentração e os resultados sugerem que o mecanismo subjancente a essa sensibilização envolve a ativação de AMPc/PKA e a inibição de correntes de K+ do tipo A. O modelo in vitro proposto para o estudo da sensibilização periférica reproduz resultados encontrados em outros modelos experimentais e pode contribuir para o entendimento da sensibilização nociceptiva e desenvolvimento de fármacos com ação analgésica.
Abstract: Introduction: Prostaglandin E2 (PGE2) is an inflammatory mediator able to sensitize peripheral sensory neurons and cause hyperalgesia. Studies suggests that the molecular mechanism involved in the sensitization by PGE2 is dependent on the activation of adenylate cyclase/cAMP/PKA pathway, and also, modifications in ion channels, as potassium channels (K+). Objectives: Study the depolarization induced by PGE2 in cultures of primary sensory neurons using fluorescence microscopy, as a possible model for studies of sensitization of nociceptors and evaluate the involvement of K+ channels in this process. Materials and Methods: Primary cultures of neurons were cultivated from the dorsal root ganglia (DRG) of adult rats and variations in membrane potential were recorded by confocal microscopy through variation of fluorescence emitted by neurons in the presence of DiBAC4(3) indicator. The effect of administration of PGE2, db-cAMP (cAMP analogue), H89 (PKA inhibitor), morphine and the K+ channel blockers: glibenclemida, TEA and 4-AP were evaluated. Also, the membrane potential of neurons isolated from animals treated in vivo by intraplantar injection of PGE2 were evaluated Results: The PGE2 (1, 10 and 100 nM) depolarized neurons of concentration-dependent manner, and this effect occurred predominantly in neurons of smaller diameter (10 to 20 µm). In addition, in cultures of neurons obtained from dorsal root ganglia (L4 and L5) ipsilateral to the treatment by intraplantar with PGE2 (100 ng) in rats, there was a depolarized resting potential in relation to isolated neurons of contralateral ganglia of the same animals, evidencing a correlation between the effect in vivo and in vitro of PGE2. With regard to the involvement of adenylate cyclase/cAMP/PKA in the sensitization of sensory neurons by PGE2, it was noticed that the administration of db-cAMP induced depolarization in a similar manner to the ones observed with PGE2 (100 nM) and that the depolarization induced by PGE2 is inhibited in the presence of H89. Also the effects of selective inhibitors of K+ channels were tested and it was observed that 4-AP, a type A channel blocker, depolarized neurons in a similar manner to PGE2. In addition, it was observed that the PGE2 shows no effect after depolarization induced by 4-AP and it also does not alter the membrane potential of neurons previously despolarizadas by PGE2. These results indicate that PGE2 and 4-AP acts on the same K+ channels. The effect of morphine was also tested, an analgesic whose peripheral effect is dependent on the opening of K+ channels sensitive to ATP, and the results have shown that morphine inhibits depolarization induced by PGE2 and also by 4-AP, evidencing that PGE2 and morphine act on different K+ channels. Conclusion: In conclusion, the PGE2 depolirized DRG neurons in a concentration – dependent manner and the results suggest that the subjancente mechanism to this sensitization involves the activation of cAMP/PKA and the inhibition of K+ currents type A. The proposed in vitro model for the study of peripheral sensitization shows similar results found in other experimental models and can contribute to the understanding of nociceptive sensitization and development of drugs with analgesic action.
Keywords: Prostaglandin E2
Hyperalgesia
Ciências médicas
Prostaglandinas
Nociceptividade
Hiperalgesia
Prostaglandina E2
Nocicepção
Gânglio da raiz dorsal
Canais de potássio
Nociception
Dorsal root ganglia
Potassium channels
Area (s) of CNPq: CNPQ::CIENCIAS DA SAUDE
Language: por
Country: Brasil
Publisher: Universidade Federal de Uberlândia
Program: Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde
Quote: SANTOS, Débora de Oliveira. Estudo das alterações no potencial de repouso neuronal induzidas por prostaglandina E2 em culturas primárias de glânglio da raiz dorsal de ratos por meio de microscopia de fluorescência- Uberlândia. 2018. 68 f. Tese (Doutorado em Ciências da Saúde)- Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 2018. Disponível em: http://dx.doi.org/10.14393/ufu.te.2018.465
Document identifier: http://dx.doi.org/10.14393/ufu.te.2018.465
URI: https://repositorio.ufu.br/handle/123456789/21696
Date of defense: 5-Apr-2018
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