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Document type: Tese
Access type: Acesso Aberto
Title: Caracterização epigenética e funcional do Transcrito Específico do X Inativo (XIST) durante o desenvolvimento embrionário inicial in vitro em bovinos
Alternate title (s): Epigenetic and functional characterization of the X-Inactive Specific Transcript (XIST) during the in vitro early embryo development in cattle
Author: Mendonça, Anelise dos Santos
First Advisor: Franco, Maurício Machaim
First member of the Committee: Bonetti, Ana Maria
Second member of the Committee: Macedo, Gustavo Guerino
Third member of the Committee: Dode, Margot Alves Nunes
Fourth member of the Committee: Figueiredo, Ricardo Alamino
Summary: Durante o desenvolvimento inicial de mamíferos ocorre, nos embriões fêmeas, o evento da inativação do cromossomo X (ICX), o qual é regido predominantemente por fatores epigenéticos. Na espécie murina sabe-se que o RNA longo não-codante (lncRNA) Transcrito Específico do X Inativo (XIST), juntamente com um pequeno RNA denominado Rep A, são essenciais para a iniciação do processo de ICX, mas muito pouco ainda se sabe sobre esses eventos iniciais em espécies domésticas de interesse comercial. Este estudo teve como objetivo caracterizar o padrão de metilação de DNA e de expressão do lncRNA XIST durante o desenvolvimento inicial de bovinos. Foram avaliados os padrões de metilação do DNA em três regiões diferentes da porção 5’ e primeiro éxon do XIST (denominadas aqui promotor, Rep A e DMR 1) em gametas, embriões e placenta. Com relação à caracterização da expressão de XIST, foi investigado o perfil de expressão em blastômeros individuais, além da expressão fita-específica (transcrição sense e antisense) ao longo do gene. Para as avaliações de metilação foi utilizada a técnica de amplificação de DNA tratado com bissulfito de sódio por PCR seguido de sequenciamento. Para a expressão gênica em células embrionárias individuais foi utilizado o kit Single Cell-to-CT (Ambion). Para a detecção de transcritos sense e antisense foram utilizados primers gene-específicos para a síntese do cDNA. As reações de PCR em tempo real foram realizadas utilizando Fast Sybr Green Master Mix (Applied Biosystems). Os padrões de metilação do DNA para a DMR 1 e Rep A foram calculados para espermatozoides (3,33% ± 1,05 e 10,36% ± 3,73, respectivamente), ovócitos imaturos (79,54% ± 6,56 e 12,29% ± 4,21, respectivamente) ovócitos maturados (89,59% ± 2,31 e 74,27% ± 8,77, respectivamente), embriões de 8-16 células (0,00% ± 0,00 e 92,18% ± 2,22, respectivamente), mórulas (0,84% ± 0,57 e 95,33% ± 0,51, respectivamente), massa celular interna de blastocistos (1,07% ± 0,72 e 1,97% ± 1,41, respectivamente), células do trofoectoderma de blastocistos (3,93% ± 1,24 e 0,00% ± 0,00, respectivamente), placenta (alantocórion) de duas fêmeas [A (89,38% ± 2,70 e 26,92% ± 11,27, respectivamente) e B (70,92% ± 10,70 e 89,24% ± 2,50, respectivamente)] e placenta (alantocórion) de dois machos [A (94,67% ± 1,18 e 88,78% ± 5,40, respectivamente) e B (94,44% ± 1,58 e 92,22% ± 2,07, respectivamente)]. Os padrões de metilação para espermatozoides e ovócitos maturados para a região do promotor de XIST foram 3,12% ± 1,68 e 46,67% ± 10,58, respectivamente. Os padrões de metilação encontrados sugerem que essas regiões são tDMRs, as quais se reprogramam em momentos diferentes entre si, porém, não são regiões que poderiam conferir um caráter imprinted ao XIST. Além disso, a região Rep A pode ser uma candidata à um marcador epigenético na PIVE devido à sua reprogramação durante a maturação ovocitária. O RNA XIST foi detectado em ovócitos MII e células individuais de embriões do estágio de 2-células até mórula, indicando a presença de transcritos tanto de origem materna quanto embrionária. Além disso, foram detectados transcritos sense e antisense no início e final do locus XIST em embriões e tecido testicular, podendo ser um ou mais transcritos diferentes. A caracterização molecular do gene XIST em bovinos é um passo inicial e importante para entender os eventos relacionados à ICX durante a embriogênese, de forma a aprimorar as ARTs.
Abstract: During the initial development of mammals, an event of X chromosome inactivation (XCI) occurs in female embryos, which is predominantly coordinated by epigenetic factors. In mice, it is known that the long non-coding RNA (lncRNA) X-Inactive Specific Transcript (XIST), in association with a small RNA named Rep A, are essentials to the initiation of the XCI process. However, little is known about this mechanism in domestic animals. The aim of this study was to characterize the DNA methylation and gene expression patterns of the lncRNA XIST during the early development in cattle. Three different regions of 5’ portion and first exon of XIST were evaluated for DNA methylation (named here as promoter, Rep A and DMR 1) in gametes, embryos and placenta. Regarding gene expression, it was investigated the expression pattern in individual blastomeres, as wells as strand-specific expression (sense and antisense transcription) along the gene. For DNA methylation, PCR of sodium bisulfite treated-DNA followed by DNA sequencing was used. Single cell-to-CT (Ambion) kit was used for gene expression of oocytes and individual embryonic cells. Regarding sense and antisense gene expression, genespecific primers were used for cDNA synthesis. Real-time PCR was conducted using Fast Sybr Green Master Mix (Applied Biosystems). DNA methylation patterns for DMR 1 and Rep A were determined in spermatozoa (3.33% ± 1.05 and 10.36% ± 3.73, respectively), immature oocytes (79.54% ± 6.56 and 12.29% ± 4.21, respectively) matured oocytes (89.59% ± 2.31 and 74.27% ± 8.77, respectively), 8- 16 cell embryos (0.0% ± 0.00 and 92.18% ± 2.22, respectively), morula (0.84% ± 0.57 and 95.33% ± 0.51, respectively), inner cell mass of blastocysts (1.07% ± 0.72 and 1.97% ± 1.41, respectively), trophoectoderm of blastocysts (3.93% ± 1.24 and 0.00% ± 0.00, respectively), placenta (allantochorion) of two females [A (89.38% ± 2.70 and 26.92% ± 11.27, respectively) and B (70.92% ± 10.70 and 89.24% ± 2.50, respectively)] and placenta (allantochorion) of two males [A (94.67% ± 1.18 and 88.78% ± 5.40, respectively) and B (94.44% ± 1,58 and 92.22% ± 2.07, respectively)]. The methylation profile in spermatozoa and matured oocytes for XIST promoter region were 3.12% ± 1.68 e 46.67% ± 10.58, respectively. The methylation patterns found here suggest that these regions are transient differently methylated regions (tDMRs), which are reprogrammed in different time, and are not regions that could give an imprinted character to the XIST. Moreover, Rep A is a candidate for epigenetic marker in in vitro fertilization (IVF) due to it is reprogramming during oocyte maturation. XIST RNA was detected in matured oocytes and individual cells of embryos of 2-cell until morula stages, suggesting the presence of transcripts of both maternal and embryonic origins. Moreover, sense and antisense transcripts were detected at the first and last exons of the XIST locus in embryos and testicular tissue, which may be one or more different transcripts. The molecular characterization of XIST gene in cattle is an initial and important step to understand the events related to XCI during embryogenesis in order to improve the assisted reproductive techniques.
Keywords: Bos taurus indicus
Inativação do cromossomo X
Expressão gênica
Metilação do DNA
Impriting genômico
XIST
Genomic imprinting
X chromosome inactivation
Bos taurus indicus
DNA methylation
Gene expression
Area (s) of CNPq: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::GENETICA::GENETICA ANIMAL
CNPQ::CIENCIAS AGRARIAS::MEDICINA VETERINARIA::REPRODUCAO ANIMAL
Language: por
Country: Brasil
Publisher: Universidade Federal de Uberlândia
Program: Programa de Pós-graduação em Genética e Bioquímica
Quote: MENDONÇA, Anelise dos Santos. Caracterização epigenética e funcional do Transcrito Específico do X Inativo (XIST) durante o desenvolvimento embrionário inicial in vitro em bovinos. 2017. 159 f. Tese (Doutorado em Genética e Bioquímica) - Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 2017.
Document identifier: http://dx.doi.org/10.14393/ ufu.te.2018.5
URI: https://repositorio.ufu.br/handle/123456789/20723
Date of defense: 8-Dec-2017
Appears in Collections:TESE - Genética e Bioquímica

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